基于HMGB1/RAGE/TLR2/4探索扶正透邪方对肺炎大鼠免疫失衡的逆转机制

Pneumonia caused by drug-resistant bacterium was an urgent problem in the medical fields. Antibiotic treatment could induce bacterial resistance, while Traditional Chinese Medicine （TCM）could prevent it, TCM treated it with the heat-clearing and detoxicating usually. Immune imbalance was the important pathological mechanism of the pneumonia, Qi Gui Yin prescription focusing on “strengthening healthy qi to eliminate pathogens” was chosen by the research group, showing the definite clinical effect, but the mechanism remained to be elucidated. HMGB1 was an important target for the immune imbalance, which might participate in the immune response through RAGE and / or TLR2, 4. In the light of these, the hypothesis was put forward that Qi Gui Yin prescription might influence the HMGB1, activate RAGE and/or TLR2/4 and the other signal transduction molecules, mediate immune response, reverse immune imbalance, reconstruct immune homeostasis and have an effect on the pneumonia. In this study, pneumonia models from drug-resistant Pseudomonas aeruginosa will be constructed in SD rats, Qi Gui Yin prescription may have an effect on the pneumonia by reversing the immune imbalance, the different gene expression profiles will be obtained with Nanostring nCounter System, reverse molecular docking analysis will be had with Pharm Mapper database, molecular pathways will be resolved in gene level, the possible mechanism will be elucidated, which will provide experimental evidences for treating pneumonia with TCM.

耐药菌所致肺炎是医学界亟待解决的难题。抗生素治疗可诱导细菌耐药，中药无此风险，多以清热解毒为治法。免疫失衡是肺炎的主要病理机制，本课题组选以扶正透邪为总治则的芪归银方开展研究，临床疗效肯定，但作用机制尚待阐明。高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是影响免疫失衡的重要分子靶标，可通过晚期糖基化终产物受体（RAGE）和/或Toll样受体（TLR）2/4参与免疫应答。基于此，提出假说：芪归银方可能通过影响HMGB1，活化RAGE和/或TLR2/4等信号转导分子，介导免疫应答，逆转免疫失衡，重建免疫稳态，对肺炎发挥疗效。本研究拟以耐药铜绿假单胞菌建立大鼠肺炎模型，在证实芪归银方可通过逆转免疫失衡治疗肺炎的基础上，以单分子多重基因表达谱分析技术获得差异基因表达谱，转化后用Pharm Mapper数据库进行反向分子对接分析，从基因水平解析分子通路，阐明可能的作用机制，为中药治疗耐药菌所致肺炎提供实验依据。

将耐药铜绿假单胞菌以不同途径感染SD大鼠，观察比较各组肺组织病理学改变及机体免疫学变化，结合分离出的铜绿假单胞菌特性，综合分析后确定采用滴鼻感染途径，以此成功建立并科学评价了耐药铜绿假单胞菌致肺炎的 SD大鼠模型。.在此模型上，用临床疗效肯定、体外实验证实无直接抑菌作用的芪归银方进行干预，以病理学和免疫学技术检测了肺炎大鼠免疫病理学变化。发现PA致肺炎的大鼠肺组织的确发生了炎性改变 ，分别体现于不同层面的进行性肺炎加重及显著的炎性细胞浸润等，芪归银则可有效改善上述症状；同时发现肺炎大鼠的系列免疫指标表达失衡（如TNF-α等），芪归银亦可不同程度对此表达改变发挥逆转作用。总之，病理和免疫学结果均证实，芪归银确可有效逆转肺炎大鼠的免疫失衡状态，改善PA带来的炎性病理变化。.以单分子多重基因表达谱分析技术进一步获得各组基因表达谱，将结果涉及2倍以上的表达改变，结合文献逐一分析；针对初步判定有意义的表达改变，以GO分析、富集分析和KEGG通路解析及COG分类等方法，围绕 HMGB1 和 RAGE/TLR2/4 解析出可能的分子通路；同时对初步判断尤具意义的部分参数进行验证——以PCR方法选择性检测在不同组别中的表达状况；在此基础上对逆转免疫失衡的其它可能作用通路进行了合理性推测，更有海量结果尚待进一步分析验证。.另外，本研究探索性的蛋白检测结果提示，芪归银可能通过影响耐药铜绿假单胞菌的部分蛋白表达，从而影响其耐药特性和/或致病性，但结果尚待其它不同原理的方法佐证，相关机理更待进一步研究揭示。.综上所述，芪归银确可有效逆转肺炎造成的机体免疫失衡，除HMGB1的相关信号转导通路外，还存在其它通路，亟待进一步研究揭示；未来研究中，也许蛋白水平的探索或可规避翻译修饰环节的影响，从而结合其明确的生物学特性更能直接揭示芪归银效用机理，值得探索尝试。