低氧外泌体调控CSPCs归巢分化促进软骨原位再生的研究

Cartilage in situ regeneration provides a new option for cartilage defect repair, and the core of cartilage in situ regeneration--stimulating stem cells homing and differentiation in cartilage defect area， remains a difficult problem. Some studies indicated that hypoxia environment could promote the homing and differentiation of stem cells, and the exosomes plays a vital role in transmitting signal of cell homing and differentiation. Therefore, we try to explore the feasibility and mechanism of CSPCs homing and differentiation mediated by hypoxic exosomes in promoting cartilage in situ regeneration. First, we want to study the effect of hypoxia on migration and differentiation of CSPCs in vitro. Secondly, we would study the effect of exosomes derived from stem cells under hypoxia on the migration and differentiation of CSPCs, and the ability of homing and differentiation in vivo. Then, exosomes was harvested from stem cells treated with HIF-1 alpha over-expression or interfered with HIF-1 alpha shRNA, the impact of exosomes mediated HIF-1 alpha on CSPCs migration and differentiation was assessed; finally, exosomes from stem cell treated with over expression of HIF-1 alpha combined with hydrogel was transplanted into cartilage defects to explore the mechanism of HIF-1 alpha mediated hypoxia exosomes regulating CSPCs homing and differentiation in cartilage regeneration in situ.

软骨原位再生技术为软骨缺损修复提供了一种崭新的治疗方法，而软骨原位再生技术的核心—刺激干细胞迁移归巢至软骨缺损区依然是个难题。研究表明低氧环境可以促进干细胞归巢分化，而外泌体在传递细胞归巢分化信号过程中起着重要作用。因此，我们拟探索低氧预处理干细胞来源外泌体调控CSPCs归巢分化促进软骨原位再生的可行性及相关机制。首先，研究低氧对CSPCs体外迁移分化能力的影响；其次，研究低氧预处理的干细胞来源的外泌体对CSPCs体外迁移分化和体内归巢分化能力的作用。再次，过表达或干扰干细胞中HIF-1α后获取外泌体，评价外泌体介导HIF-1α对CSPCs迁移分化的影响；最后，将过表达HIF-1α的干细胞来源外泌体复合水凝胶移植到软骨缺损部位，探索低氧外泌体介导HIF-1α 调控CSPCs归巢分化促进软骨原位再生的相关机制。

软骨来源干细胞为软骨组织工程提供理想种子细胞。我们利用纤维连接蛋白黏附法从软骨中分离培养软骨干细胞,并进行传代。这一群细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD 29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45。经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆。三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能 力。我们比较了软骨细胞，骨髓间充质干细胞，以及软骨干细胞的增殖能力，发现软骨干细胞的增殖能力要高于软骨细胞（P〈0.05），然而低于骨髓间充质干细胞的增殖能力 （P〈0.05）； 在比较软骨细胞和骨髓间充质干细胞，以及软骨干细胞的成软骨能力， 我们发现软骨干细胞的成软骨能力要明显优于骨髓间充质干细胞（P〈0.05），并且不容易发生血管化。组织学染色和GAG，以及软骨特异性基因的表达（aggrecan, collagen II， Sox-9等）检测结果也证实了以上结论。 . 外泌体（Exosomes）是细胞分泌到胞外的一种囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动。低氧是各种病症中常见的生理和病理应激反应,且外泌体广泛参与了低氧损伤机制及其适应机制。在目前的研究中，我们检测了低氧ADSCs来源的EV的特征，评估低氧性脂肪干细胞（ADSCs）来源EVs对CSPCs增殖，分化和凋亡的影响。结果表明，大多数ADSC来源EVs呈圆形或圆杯状形态，直径40–1000 nm，表达CD9、CD63和CD81。低氧的ADSCs来源的EVs增强了CSPCs的迁移和增殖和分化，并且增加软骨相关基因的表达，产生更多的软骨基质和蛋白多糖。. 在本课题的资助下，我们发表了5篇 SCI 文章,正在申请的专利2项。