中国野葡萄SBP转录活性、定位及其特异启动子功能研究

葡萄白粉病是严重危害欧洲葡萄的一种世界性真菌病害。本研究是在前期研究获得中国野葡萄SBP(SQUAMOSA promoter binding protein)转录因子cDNA及其功能分析的基础上，以高抗葡萄白粉病的中国野葡萄白河-35-1为研究对象，一方面是进行中国野葡萄SBP转录因子转录活性分析、亚细胞定位、原核表达分析，并通过免疫细胞化学分析与定位分析研究转录因子基因在细胞内的表达定位；另一方面是采用染色体步移法克隆SBP转录因子特异启动子，并进行顺式作用元件分析。构建中国野葡萄SBP转录因子特异启动子缺失表达载体、SBP与其启动子融合表达载体，通过转化模式植物烟草、拟南芥，进行病原菌接种或信号物质处理的表型分析，研究启动子功能。为进一步阐明SBP转录因子作用机理、研究与其互作的下游靶基因功能，最终弄清抗白粉病的分子机理提供理论基础。

从中国野生葡萄华东葡萄克隆了18个SBP基因家族成员，其中12个含有与miRNA156/157互补的序列。系统发育树表明植物中的SBP基因可以分为7个亚族，其中葡萄SBP基因与双子叶被子植物的亲缘关系较近，而与单子叶被子植物的亲缘关系较远。对SBP基因在葡萄不同组织及果实发育不同阶段的时空表达模式分析表明，没有miR156/157靶位点的葡萄SBP基因表现为组成型表达。而具有miR156/157靶位点的葡萄SBP基因因为microRNA的抑制作用表现出不同的表达模式。基因表达芯片数据以及盐胁迫和外源激素处理后的实时定量RT-PCR分析表明部分葡萄SBP基因可能参与了对生物与非生物胁迫的防御；中国野葡萄VpSBP16基因完整开放阅读框序列全长1674 bp，编码558个氨基酸，定位核里且都具有转录激活活性。构建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16过量表达载体，过量表达VpSBP16明显提高了转基因植株对渗透胁迫，失水，干旱以及盐胁迫的耐受力；中国野葡萄VpSBP5基因完整开放阅读框序列全长3090 bp，编码1030个氨基酸。VpSBP5基因的表达在抗白粉病‘白河-35-1’比感病的‘湖南-1’中有更快的反应。VpSBP5可能通过SA、MeJA信号分子途径来调控葡萄对白粉病的抗性。克隆了VpSBP5基因启动子，构建了2个SBP上游调控序列与GUS报告基因融合载体，所克隆的2个SBP上游调控序列均具有病原菌诱导活性，中国野葡萄SBP5启动子活性高于欧洲葡萄SBP5基因启动子的活性；中国野葡萄VpSBP11基因完整开放阅读框序列全长510 bp，编码170个氨基酸。VpSBP11过量表达表明VpSBP11基因具有拟南芥早开花功能。构建VpSBP3, VpSBP11和VpSBP15基因重组原核表达载体pGEX-VpSBP，转化大肠杆菌Rosetta（DE3），以IPTG为诱导剂诱导目的融合蛋白的表达，重组原核表达载体pGEX-VpSBP在DE3中高效表达出了融合蛋白，免疫新西兰兔后得到了抗血清，经Western-Blot检测，免疫大白兔获得的血清特异性强，可用于SBP基因功能分析。邀请国内外专家6人次来校学术交流；参加国内外学术会议4次；发表学术论文13篇，其中SCI论文10篇；培养学术带头人1人；培养研究生9人，其中博士生3人；申请国家发明专利1项。