Smad/c-Jun氨基末端激酶信号通路在先天性尿道下裂发生中的作用和机制研究

Hypospadias is one of the most common congenital anomalies. Whole genome microarrays analysis of hypospadiac tissue from rats indicated a potential role for transforming growth factor-beta (TGF-β) and mitogen activated protein kinase (MAPK) in the development of this anomaly at the latest reports. However, the role and mechanism of Smad (TGF-β downstream signaling) and JNK (one member of MAPK family) in hypospadias development is largely uncharacterized. Our previous studies carried out in human foreskin tissue and first found the expression of Smad7, Smad2/3, JNK1 and JNK2 of hypospadic patients’ foreskin tissue significantly increased compared with normal controls, which suggests Smad and JNK have an close relationship with hypospadias. Based on these, we proposed the hypothesis: once Smad7 and Smad2/3 function were interfered, JNK1/2 phosphorylation activation was disabled, cell migration inhibition will occur during urinary tract development, and which leads to congenital hypospadias. This project is going to use our previous built hypospadiac animal model which was similar to human hypospadias occurrence. Technical methods as cytology, histology and organology were used so as to identify the relationship between Smad and JNK and between JNK and hypospadias development, and the regulatory mechanism among them. The completion of this project can provide a new methods and scientific basis for screening experiments biopharmaceutical targets and hypospadias deformity prevention.

先天性尿道下裂是最常见的泌尿系畸形之一，最新报道在尿道下裂大鼠全基因组芯片中发现TGF-β和MAPK信号系统表达最丰富。而TGF-β下游信号Smad以及MAPK成员JNK在尿道下裂发生中的作用和机制尚不清楚。课题组前期工作在人类阴茎包皮组织中进行，首次发现Smad7、Smad2/3、JNK1和JNK2的表达在尿道下裂患者包皮组织中较正常对照明显上调，提示Smad、JNK与尿道下裂发生相关。基于此，本课题提出Smad7和Smad2/3正常功能行驶受阻，使JNK1/2蛋白磷酸化活化障碍，导致尿道缝上皮细胞的细胞迁移障碍，从而形成先天性尿道下裂。课题拟利用前期成功构建的类似于人类尿道下裂发生的大鼠模型，分别从组织学、细胞学和器官学等方面分析，明确Smad与JNK以及JNK与尿道下裂发生之间的关系及其调控机制，本课题的完成可为筛选生物制药靶位和尿道下裂畸形的科学预防提供新思路和科学的实验依据。

先天性尿道下裂是一种常见的泌尿生殖畸形疾病，但其病因尚不清楚；本研究以最新的基金芯片结果为基础，深入研究Smad和JNK信号在尿道下裂发生中的作用和机制。.本项目利用前期Smad7、Smad2/3、JNK1和JNK2表达在人尿道下裂患者包皮组织中表达上调和成熟的尿道下裂大鼠模型，发现在尿道下裂大鼠阴茎组织中JNK（1，2）1和Smad（7，3，2）表达均较正常均显著上调（p<0.05）。为进一步明确信号级联系统之间的调控关系；我们从细胞学水平上研究人包皮成纤维细胞（HFF-1），根据MTT确定的最适干预浓度和剂量分组为：NC组：常规细胞培养组；MEHP组：添加含200μM浓度MEHP的细胞培养组；E2组：添加含100pg/ml 17β-雌二醇（E2）的细胞培养组；MEHP+TGF-β1组：添加含200μM浓度MEHP和200ng/mTGF-β1的细胞培养组；MEHP+SP600125组：添加含200μM浓度MEHP和 SP600125拮抗剂细胞培养组。通过凋亡实验明确了各个干预因素对目的细胞增殖及凋亡无影响，进一步细胞划痕试验发现在细胞迁移力上MEHP表现出雌激素样作用，这种作用能被TGF-β1上调而增强，同时也能被SP600125抑制。进一步基因和蛋白水平发现JNK1、JNK2、Smad7、Smad3和Smad2 mRNA水平以及T-JNK、p-JNK1、p-JNK2、Smad7、p-Smad2和p-Smad3蛋白表达水平在MEHP组较NC组显著升高，而在E2组升高更明显（p<0.05）。但在MEHP+TGF-β1组这种表达较单纯MEHP组升高，而在MEHP+SP600125组，这种升高会明显减弱，提示MEHP具有雌激素样作用，而SP600125具有逆转MEHP作用，从而保护细胞正常生长发育。.通过本课题研究，我们认为尿道下裂的发生是由于DEHP等雌激素样因素作用下，TGF-β1表达上调，刺激Smad7和磷酸化Smad3、Smad2表达增强，升高了JNK1和JNK2蛋白的磷酸化水平，从而抑制了人包皮成纤维细胞的细胞迁移和增殖，加速细胞凋亡，导致包皮和尿道缝的腹侧卷管成形障碍，而造成尿道下裂畸形。同时，我们发现SP600125可能具有预防尿道下裂发生的作用，有待进一步验证。本项目的顺利完成为先天性尿道下裂畸形的预防奠定了基础，有助于进一步筛选生物制药靶位。