HOXB7通过TET1介导的去甲基化机制调控骨肉瘤细胞干性特征及肺转移的实验研究

Lung metastasis is a key factor that influences the survival of osteosarcoma (OS) patients. Combining DNA methylation MeDIP_Chip, expression microarray and cross-species (dog-to-human) comparative oncogenomics approaches, we found that HOXB7 was upregulated in the metastatic OS cells /tissues and acted as an oncogene, and upregulation of HOXB7 was correlated with hypomethylation of its promoter. Furthermore, HOBX7 was also activated in metastatic CD117+Stro-1+ OS stem cells by promoter hypomethylation. DNA methylating drugs suppressed the HOXB7 expression and promoted the differentiation of OS stem cells. Moreover, HOXB7 activated the Notch signaling pathway by regulating the TET1 (methylcytosine dioxygenase) expression. The objectives of this project are to explore the key role of HOXB7/TET1/Notch pathway in controlling the metastatic OS stem cells using the models of multiple-species OS cell lines, mice xenograft, genetically engineered mouse, and clinical tumor/blood samples. The present study will serve to provide a novel target for the anti-metastasis therapy and improve the overall survival of osteosarcoma patients.

肺转移是制约骨肉瘤患者预后的关键因素。我们前期联合运用甲基化和表达谱芯片并结合跨种属（人和犬）癌基因组学研究策略，发现HOXB7的表达在转移性的人和犬骨肉瘤细胞及组织中均显著升高，且与其启动子低甲基化密切相关；并且还证实HOXB7在骨肉瘤转移中起着癌基因的功能。进一步实验发现，HOXB7在骨肉瘤转移性干细胞（CD117+Stro-1+）中低甲基化异常激活，甲基化药物能降低HOXB7表达并促进骨肉瘤干细胞分化；同时，HOXB7可调控去甲基化酶TET1活性并激活Notch信号通路。本项目拟在前期基础上，进一步在多种属肿瘤细胞、移植瘤及转基因小鼠模型、临床组织及血液标本等多层面，逐级纵向阶梯式验证HOXB7通过TET1介导的去甲基化机制活化Notch信号通路调控骨肉瘤转移性干细胞的关键性作用，旨在为突破骨肉瘤肺转移治疗瓶颈，提高骨肉瘤总体预后带来新的临床启示。

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，早期极易发生肺转移。肺转移患者的5年生存不足20%，肺转移是治疗失败的主要原因。DNA甲基化是一种不依赖于遗传基因改变的可逆的表达调控方式，研究肿瘤转移的甲基化异常机制将为抗转移治疗提供新的途径。本项目前期通过对比研究两株具有高低转移特性的原代骨肉瘤细胞全基因组甲基化及转录组数据，并联合分析犬骨肉瘤原位和肺转移肿瘤的转录组信息，发现HOXB7 在两种属转移细胞或组织中的表上调，并与启动子低甲基化相关，提示HOXB7 可能是种属间保守的肺转移表观遗传学相关基因。.研究表明，肿瘤干细胞中存在一部分具有转移特性的细胞亚群，称为转移干细胞。我们发现CD117+Stro-1+骨肉瘤干细胞与转移能力密切相关，而HOXB7在转移性的CD117+Stro-1+细胞中高表达。干扰HOXB7表达可以抑制CD117+Stro-1+细胞的自我更新、体内成瘤及肺转移能力。机制研究表明，HOXB7可直接调控TET1去甲化酶的表达，而TET1又可通过去甲基化机制激活HOXB7，从而形成HOXB7/TET1去甲基化正反馈调控机制，通过活化Notch通路，促进骨肉瘤细胞的转移特性。甲基化药物AdoMet可抑制HOXB7/TET1/Notch信号环路抑制骨肉瘤干细胞的转移能力。免疫组化分析显示，HOXB7在骨肉瘤肺转移组织中高表达，原位肿瘤高表达HOXB7的患者预后较差且较早发生肺转移。而外周血肿瘤循环DNA（ctDNA）中的HOXB7启动子低甲基化的患者肺转移的风险明显增高。.综上所述，本研究揭示了HOXB7通过TET1去甲基化正反馈调控机制激活Notch信号通路在骨肉瘤干细胞转移特性维持中的重要作用，为靶向HOXB7/TET1甲基化环路抑制肿瘤干细胞转移能力提供临床前期证据，并阐述了外周血ctDNA的HOXB7启动子甲基化检测在骨肉瘤肺转移风险预测的临床价值。