Epimorphin在肝癌细胞转移中的作用及其机制研究

在肝癌的发生发展过程中，肝星状细胞（HSC）分泌的可溶性因子、细胞外基质构成的肿瘤微环境发挥了不容忽视的作用。从2005年以来，我们一直致力于肝脏中HSC表面特异性膜蛋白-Epimorphin的调控机制研究。近年来，有两项在转基因小鼠中的研究暗示：Epimorphin可能与肿瘤发生相关。我们的前期研究表明：（1）在肝癌组织中，Epimorphin高表达于激活的HSC，不表达于肿瘤细胞；（2）HSC条件培养基可以促进肿瘤细胞的浸润；（3）肿瘤细胞与HSC共培养可以上调HSC中Epimorphin的表达水平；（4）外源性过表达Epimorphin可以显著增强肿瘤细胞的浸润能力。综上所述，我们提出了工作假说：HSC表面的Epimorphin通过FAK-ERK-MMPs信号通路促进肝癌细胞的转移。我们将通过体外浸润实验，裸鼠体内肝癌转移模型，临床肝癌标本三个方面来验证我们提出的假说。

本课题的研究目的在于验证我们之前提出的工作假说：HSC 表面的Epimorphin 通过FAK-ERK-MMPs 信号通路促进肝癌细胞的转移。在研究当中，我们构建了EPM 下调表达的肝星状细胞株LX-2-shEPM，观察到EPM下调后的肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞的增殖能力无显著影响。我们将野生型和EPM敲低的LX-2 细胞系，按照合适的比例与肝癌细胞系混合后，进行裸鼠皮下成瘤实验，1个月后，干涉EPM组与对照组的肿瘤重量无显著性差异。这些体内外结果表明EPM对于肿瘤细胞的增殖能力无显著性作用。在体外transwell浸润实验中，我们观察到EPM下调后的肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞的转移促进能力有下降。我们将下调EPM的肝星状细胞与肝癌细胞混合后，注射入裸鼠肝脏，6-7周后观察和比较肝内外转移结节的数量和进行病理分析。结果表明，干涉了EPM的LX-2细胞，其促进肝癌细胞肝内转移的能力显著下降。我们也构建了过表达EPM的肝癌细胞系，并在裸鼠体内进行了肝内转移实验。结果显示过表达EPM组与对照组有显著性差异，肝内转移结节数显著增加，向肺内转移的结节数也显著增加。这些结果表明EPM可以在体内外促进肝癌细胞的转移。在此基础上，我们对EPM促进肝癌细胞转移的机制进行了探讨。我们的结果表明，肝癌细胞过表达EPM后，MMP-9的表达在mRNA水平、蛋白水平上都有显著性增加。在裸鼠体内的实验也证明了MMP-9的上调。而干涉MMP-9表达后，肝癌细胞体外浸润能力下降。过表达EPM后，磷酸化的FAK、ERK1/2表达水平增加。在EPM过表达肝癌细胞系中下调FAK后，MMP-9表达水平下调，肝癌细胞体外浸润能力下降。在EPM过表达肝癌细胞系中采用ERK 抑制剂PD98059抑制ERK磷酸化水平后，MMP-9表达水平下降，细胞体外浸润能力下降。这些结果表明EPM促进肝癌转移是通过FAK-ERK-MMP9信号通路轴发挥作用。本课题研究不仅可以使我们很好的理解EPM在肝癌转移中的作用，亦有可能为针对临床肝癌发生与转移的“靶向微环境疗法” 提供新的作用靶点，因此具有比较重要的研究价值。本课题研究发表SCI论文2篇，中文核心期刊2篇，申请国家专利1项，三名研究生毕业，相关研究内容和实验室其它研究成果一起申请获得了北京市科学技术奖一等奖（通过终审，2014，证明材料见附件）。