基于P13K-Akt-mTOR-自噬轴研究益气活血通络法拮抗脑缺血再灌注损伤的分子机制

Our previous studies found that : the method ,the TCM benefiting qi for activating blood circulation to free the collateral vessels theory treat cerebral ischemia and reperfusion injury (CIRI) ,is effective, and through regulating the expression of AktmRNA /protein and related apoptotic factors, this method protects the damaged nerve cells and promotes neurological recovery. This further study explores the PI3K-Akt-mTOR-autophagy axis pathway and tries to find the possible mechanisms of the antagonism of CIRI. The method copies the MCAO / R rats model, using lentivirus tracking, fluorescence imaging, electron microscopy ,Western blot and Real-time PCR methods, and focuses on how benefiting qi for activating blood circulation to free the collateral vessels theory of Chinese medicine influences the expression of autophagy, autophagy-related molecules and the key access factors PI3KI-p-Akt-mTORC1-p-P70S6K after cerebral ischemia and reperfusion. Further elaborate the potential valid targets of benefiting qi for activating blood circulation to free the collateral vessels theory medicine treats cerebral ischemia and reperfusion injury .This method provides new scientific evidence for clinic through developing a significant clinical traditional Chinese medicine with independent intellectual property rights which can effectively treat ischemic cerebrovascular disease, and then enriches the content of Chinese treatment rules.

基于课题组前期系列研究发现：中医益气活血通络法防治脑缺血再灌注损伤(CIRI)疗效肯定，可通过调控AktmRNA/蛋白及其相关凋亡因子的表达，保护受损神经细胞、促进神经功能恢复。本研究进一步从PI3K-Akt-mTOR-自噬轴通路，探讨该治法拮抗CIRI的可能机制。复制MCAO/R大鼠模型，应用慢病毒追踪、荧光成像、电镜、Western blot和Real-time PCR等方法，重点研究益气活血通络中药对脑缺血再灌注后自噬体、自噬流、自噬相关分子以及通路关键因子PI3K-p-Akt-mTORCI-p-P70S6K表达的影响：从PI3K-Akt-mTOR-自噬轴的分子作用途径深入阐释益气活血通络中药拮抗脑缺血再灌注后神经损伤的有效作用靶点。为临床研制出疗效显著、具有自主知识产权的治疗缺血性脑血管病的中药复方提供全新的科学依据，进而丰富中医治则治法学内容。

缺血性中风是世界上第三大致死原因，起病急，发病率、病死率、致残率和复发率高。益气活血通络中药芪蛭胶囊是黑龙江中医药大学附属第一医院已故著名专家于忠学教授多年治疗缺血性中风的经验方，临床应用中取得了良好的效果，在治疗缺血性中风方面具有良好的应用前景。本课题组前期系列研究发现，益气活血通络法之芪蛭胶囊能减轻脑水肿，提高脑组织SOD活性，减少MDA和NO的生成，清除过量自由基，有效改善缺血性中风大鼠脑组织的病理形态学变化，保护脑组织神经元、线粒体形态及功能，对大鼠局灶性脑缺血具有明显的保护作用。基于以上研究背景，本课题组基于PI3K-Akt-mTOR自噬信号通路，进一步探讨该治法拮抗CIRI的可能机制。复制MCAO/R大鼠模型，采用TTC染色、干湿重法、TUNEL、免疫荧光、Western blot、 Real-time PCR和电镜等方法，重点研究益气活血通络中药对脑缺血再灌注后自噬体及自噬相关分子LC3、P62、Beclin-1、Cathepsin B、Cathepsin D以及通路关键因子PI3K、Akt、mTOR、P70S6K表达的影响。研究发现，益气活血通络中药可有效减少细胞凋亡个数，可通过下调PI3K-Akt-mTOR信号通路关键因子p-PI3K、p-Akt、p-mTOR的表达，抑制该信号通路，上调自噬相关分子Beclin-1、LC3、Cathepsin B、Cathepsin D，下调P62蛋白的表达，进一步激活细胞自噬，从而发挥拮抗CIRI的作用，神经损伤及脑组织损伤情况得到显著改善。本次研究深入阐释了益气活血通络中药拮抗CIRI后神经损伤的可能物质基础与有效作用靶点，为临床研制出疗效显著、具有自主知识产权的治疗缺血性脑血管病的中药复方提供了全新的科学依据，进而丰富中医治则治法学内容。