小RNA与Argonaute 蛋白的特异性互作及其对玉米耐渍性的调控

不定根发育的启动和伸长是玉米对淹水胁迫最重要的形态适应。本研究拟以耐渍性具有明显差异的玉米自交系为材料，人工控制幼苗生长和淹水处理条件，采用高通量的测序技术结合RNA免疫沉淀技术，分析淹水胁迫下特异性调节玉米不定根发育和生长的小RNA、AGO基因及受小RNA所调控的靶基因，探明小 RNA、Argonaute蛋白基因、靶基因三者间互作关系，阐明淹水胁迫下玉米幼苗不定根发育调控的分子基础及其与耐渍性的关系。

淹水胁迫是玉米生长期重要的非生物逆境因子。在淹水胁迫条件下，HZ32和MO17冠根的生长发育存在显著差异。在本项目中，我们以HZ32和MO17为材料构建了淹水处理不同时期玉米冠根的8个小RNA库，测序分析鉴定了26个一致性响应的miRNAs，其中7个为新的miRNAs。对4个降解组文库测序分析，发现了293个ESTs代表98个靶基因，特别是发现了11个新miRNA的17个靶基因。进一步地，通过RACE技术验证了几个代表性靶基因及其剪切位点。QPCR证实了miR164、miR167、miR393等的表达与其靶基因ARF、ids1、sid1、TIR和NAC表达的负相关。基于隐马可夫模型（HMM）我们预测并分离了17个玉米AGO蛋白（ZmAGOs）基因，这些ZmAGOs分为5个亚组。RT-PCR分析发现ZmAGO5b和ZmAGO18a在玉米根系组织中未检测到表达，15个ZmAGOs在玉米根系组织中表达；不同类型的根（初生根、冠根、种子根和侧根）组织中大多数ZmAGOs基因具有相似的表达模式，没有检测到受淹水胁迫特异性诱导表达的ZmAGO基因。进一步地，QPCR分析发现ZmAGOs在营养器官中表达量低，在繁殖器官中表达量高且表现出4种表达模式，特别是ZmAGO18b在减数分裂的雄穗中特异表达。RNA原位杂交和免疫组化证实了ZmAGO18b在减数分裂时期的花药的戎毡层和二分体中积累。RNA免疫沉淀结合RNA测序分析发现，ZmAGO18b特异性地结合zma-miR172和zma-miR319家族成员、以及LTR-Copia和LTR-Gypsy来源的siRNAs。另外，我们发现并证实了一个Mu插入ZmAGO18b的突变体。对减数分裂期的雄穗进行RNA-seq分析证实，伴随着突变体中ZmAGO18b的表达下降，其他ZmAGOs的表达却不同程度的上升，表现出一种功能补偿效应。我们发现一些ZmAGO18b特异性捕获的microRNAs的靶基因，如ids1,sid1,AP2和TCP等，其表达量在突变体中显著上升；一些花序发育相关基因（CO、FT、FLC、SOC1、AGL、AP1）的表达也显著变化。我们推测出，ZmAGO18b可能在玉米雄花建成与发育中起着重要的作用。