基于G蛋白偶联受体与配体相互作用的19F核磁共振新方法

NMR technology has encountered some difficulties in the research of membrane proteins with large molecular weight and multiple transmembrane structures. Taking the seven-transmembrane protein such as G protein-coupled receptor (GPCR) as an example, the peak of proton has become broadening and overlapping because of the larger molecular weight of itself and the detergent used for the simulated membrane environment. Moreover, 13C and 15N double labeled GPCR proteins are hardly been successfully prepared. Therefore, conventional multidimensional NMR technology is difficult to work on this protein, and other NMR methods are urgently needed for research. The 19F isotope has the advantages of high sensitivity, wide NMR chemical shift distribution, and no background signal. Therefore, this project proposes the 19F NMR method based on the ligand detection in using Aprepitant. By combining the 19F related saturation transfer and two-dimensional exchange spectroscopy, we can systematically research on the protein-ligand conformational exchange and the kinetics in a close ratio 1:1 of Neurokinin 1 Receptor (NK1R) and ligand. Meanwhile, according to the NMR research on the rotational motion of ligand's benzene ring and ring current shift calculation based on the crystal structure，we can clarify the structure of hydrogen bond network in the receptor binding pocket and the detail information of binding-vibration-dissociation process. All these research will help to make an NMR solution for the drug design and screening related to GPCR.

核磁共振技术在大分子量和多跨膜结构的膜蛋白研究中，遇到了某些困难。以七次跨膜G蛋白偶联受体（GPCR）为例，在自身较大的分子量和模拟膜环境所用去垢剂的共同影响下，氢信号展宽和重叠严重；且此类蛋白极难进行碳氮双标记，常规多维核磁技术很难发挥优势，急需拓展其他核磁方法。鉴于19F同位素具有灵敏度高、NMR化学位移分布宽和无背景信号的优点，本项目提出基于19F配体（Aprepitant）检测的核磁共振新方法，通过19F饱和转移和二维交换谱，在蛋白与配体接近1：1环境中，系统性研究GPCR中的神经激肽1受体（Neurokinin 1 Receptor）蛋白与配体结合的构象转换和动力学过程。同时，本项目采用核磁共振技术对配体中苯环旋转运动特性的研究，结合核磁环电流计算和晶体结构，阐明配体在受体结合口袋形成的氢键网络以及其结合-振动-解离的细节过程，为研究GPCR相关药物设计和筛选提供核磁的解决方案。

19F具有灵敏度高、化学位移分布宽和无背景信号的优点，在自身分子量较大、难以进行碳氮双标记的膜蛋白体系中具有应用潜力。本课题中，申请人利用19F核磁共振技术，在G蛋白偶联受体家族的神经激肽1受体（NK1R）体系中，通过19F核磁共振饱和转移（ST）和二维交换（EXSY）两种方法，研究了配体与蛋白的相互作用和动力学变化。同时，构建并优化NK1R在酵母系统中的表达方案。本项目有如下科学成果。.1 两种19F核磁方法核磁揭示了神经激肽1受体大尺度的运动（范围超过6Å），补充了在晶体和冷冻电镜中难以提供的动力学信息，提出G蛋白偶联受体与功能性配体结合的“多步骤选择”过程。同时，该类大尺度运动在不同膜环境中具有普适性.2 利用19F探针，本课题系统性研究了激动剂“多肽SP”与神经激肽1受体结合的动力学过程以及其与抑制剂“阿瑞匹坦”的竞争性结合，通过19F核磁共振方法研究了NK1R在激活态和抑制态的动力学变化。我们发现受体在E78N位点突变后，其与配体SP7F结合的动力学会发生明显变化，受体结合的SP7F与自由状态的SP7F交换速率约为3Hz。.这一系列结果表明，19F核磁共振技术在G蛋白偶联受体研究中具有广泛的应用前景，尤其在动力学研究方面具有独特的优势。申请人希望本课题对拓展核磁共振方法学和G蛋白偶连受体的结构生物学产生积极作用，也为相关药物研发和信号转导研究提供思路。