半乳糖氧化酶催化机理和功能的研究

半乳糖氧化酶（EC 1.1.3.9）是含有一个铜离子的氧化酶，它在医药检测、生物合成、造纸工业上有着广泛的应用前景。由于其催化中心含有经翻译修饰形成的3-甲硫酪氨酸，使其成为研究含铜酶活性中心形成机制的有趣对象，但是前人的研究主要集中在阐述半乳糖氧化酶活性中心的形成上。本课题首先合成了3-甲硫酪氨酸，通过活细胞的高通量筛选，获得对3-甲硫酪氨酸有特异性的氨酰-tRNA 合成酶，利用此酶将3-甲硫酪氨酸整合到酶的活性中心，实现基因编码3-甲硫酪氨酸。然后研究含有3-甲硫酪氨酸的半乳糖氧化酶的电极电势、三维结构、催化特性的变化。将进一步的揭示半乳糖氧化酶的催化机制，为酶的定向进化和人工设计新酶提供一个全新的工具和思路。同时在半乳糖氧化酶活性中心的不同位点引入3-甲硫酪氨酸，很有可能会改变半乳糖氧化酶底物特异性和催化效率，为扩大酶的应用提供基础。

半乳糖氧化酶（EC 1.1.3.9）是含有一个铜离子的氧化酶，它在医药检测、生物合成、造纸工业上有着广泛的应用前景。由于其催化中心含有经翻译后修饰形成的3-甲硫酪氨酸，使其成为研究含酮氧化酶的热点。本课题采用定向进化的方法，获得了酪氨酸酚解酶突变体，利用其可以合成3-甲硫酪氨酸和3-甲氧酪氨酸；同时采用该方法还获得对3-甲硫酪氨酸和3-甲氧酪氨酸有特异性的氨酰-tRNA 合成酶。在这两个研究的基础上实现了将3-甲硫酪氨酸和3-甲氧酪氨酸整合到半乳糖氧化酶的活性中心，活性测定表明，含有非天然氨基酸的酶是有功能的。我们将3-甲硫酪氨酸和3-甲氧酪氨酸应用新酶的设计和改造，将3-甲硫酪氨酸和3-甲氧酪氨酸整合到肌红蛋白活性中心，结果表明插入3-甲硫酪氨酸的肌红蛋白有还原酶活性，可以将羟胺还原成为铵盐，而对照则无此活性。该项目的研究成果表明，非天然氨基酸可以应用于酶的定向进化和人工设计新酶的研究，这为酶的基础和应用研究提供了新的手段和方法。