基于呼出气微生物三维指纹图的呼吸系统感染快速检测方法的研究

Respiratory infections caused millions of deaths each year. However its infection reasons remain unkown and methods for their rapid and accurate clinical diagnosis are significantly lacking, thus the flu patients often fail to receive timely and proper treatment. This project is designed to study the microbial population structures of exhaled breath and other biological samples, to identify a list of key respiratory infection causing pathogens, to study respiratory exposure risks, and finally to achieve rapid detection of respiratory detection using next generation sequence and fluorescence detection method. Using high throughput gene sequence, this study is aimed to study if there exists co-infections of bacteria and viruses, and how the microbial population structure of the respiratory system is affected when an infection occurs. More importantly, fluorescence based bioaerosol sensor is also to be used to produce 3D microbial fingerprint including microbial size, concentration and metabolic activity for exhaled breath from both ill and healthy subjects, and the produced graphs tested under different expiratory modes are then used to discern among bacterial, viral and fungal infections. Finally,the developed technology is further verified using the data obtained through the high throuhput gene sequence and information from routine blood tests such as white blood cell count, neutrophil and hemoglobin. The results from this study are expected to reveal the fundamental reasons and mechanisms for respiratory infection,to provide important guidelines for evaluating the respiratory exposure risks from air pollution, and to provide rapid,cheap and non-invasive method for clinical diagnosis of respiratory infection.The information and technology developed from this proposed project are expected to better prevent and treat respiratory infections, thus reducing the loss of human life.

呼吸系统感染每年造成几百万人的死亡，但其感染原因不明朗、且临床上缺乏快速诊断技术，无法保证患者得到及时正确的治疗。本项目主要通过利用荧光检测、高通量测序等方法研究空气及呼吸系统感染患者的呼出气等样品的微生物种群结构包括细菌、病毒与真菌；获得关键病原体清单，揭示呼吸暴露风险，实现感染的快速诊断分型。通过高通量测序研究是否存在细菌、病毒并发感染，以及细菌感染、病毒感染或真菌感染对呼吸系统固有种群结构的影响；研究利用荧光检测方法获得患者及健康人呼出气中活性微生物三维指纹图包括粒径、浓度与代谢活性来快速诊断呼吸系统感染，并研究其影响因素如呼气模式等；对比测序及血常规检测结果来验证该方法的有效性。研究结果将揭示引发呼吸系统感染的根本原因，为评价大气污染构成的呼吸系统感染风险提供科学依据，并为其临床诊断创建快速、廉价、无创的技术手段，从而更好地防范与治疗呼吸系统疾病，减少生命财产损失。

气溶胶传播造成的呼吸系统感染每年造成几百万的人员伤亡，对于低龄儿童更是首要的死亡风险。本研究发现不同城市室内外的生物气溶胶动力学存在很大差别，其中芽孢杆菌属、葡萄球菌属、微小杆菌属等为优势菌属。为临床point-of-care 检测，该研究创建了一种基于无创呼出气冷凝液采集、大流量空气采样与环介导等温扩增结合的现场快速病原体检测筛查系统，包括快速DNA 提取方法，能在1 小时之内完成样本的采集与检测。通过筛查呼吸系统感染患者的呼吸道致病菌，获得了常见致病原清单，其中流感嗜血杆菌在呼吸道感染患者咽部出现的频率最高，表明其可能是上呼吸道感染的主要致病菌，同时证明了病原菌可通过呼出气传播至空气中，相关研究成果已在重症监护室患儿病原体筛查中得到应用。本研究还发现，颗粒物的暴露还会导致菌群多样性显著降低，细菌菌群失衡，进而增加致病风险；健康人、急性上呼吸道感染与慢性肺部疾病患者的呼吸道内均携带有多种耐药菌耐药基因，并且可通过呼出气传播至空气中，其中链球菌属是喹诺酮类、四环素类和磺胺类等多种耐药基因的潜在来源。研究结果显示，革兰氏阳性细菌在空气暴露 1 小时内，细菌的总浓度和活性均未发生显著变化。通过高通量测序，发现呼吸道细菌感染后气道内的微生物群落受到了不同程度的扰动，进而利用UV-APS检测到呼出气中的微生物粒径分布、代谢活性也发生不同程度的变化。 相反，对于疑似病毒性感染病例呼出气中优势种群基本没有变化，其对应的呼出气微生物气溶胶粒径分布和荧光信号也没有明显变化。 本研究发展的基于荧光检测方法有望成为一种新的快速诊断呼吸道感染类型的无创方法。 该项目成果未来在公共卫生监测、医疗诊断、国防生物反恐和国家生物安全防御等领域有望发挥重要指导作用。该项目共发表SCI论文16篇，1篇《科学通报》封面文章和中华预防医学重点号刊物1篇，申请专利5项，获批3项。毕业博士生四名，硕士生三名，一名博士生获北京大学优秀博士论文，两名博士生获全国优秀博士生奖。项目负责人牵头组织第600次香山科学会议，在第10届世界气溶胶大会上做大会Tutorial报告，在世界生命大会、亚洲气溶胶大会上作特邀Keynote报告，获2015年中国气溶胶技术创新奖、2016年国家技术发明二等奖、第44届日内瓦国际发明展览会特别金奖与2017年度国家杰出青年科学基金资助。