急性肝脏损伤中泛素化蛋白调控的研究

内毒素诱发的肝脏损伤参与了多种肝病，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、胆汁淤积和缺血-再灌注损伤等发生和发展，是肝脏疾病的重要原因之一。由TNF-α所介导的肝细胞死亡是内毒素诱发肝脏损伤过程的主要因素。研究表明，蛋白泛素化修饰在TNF-α/NF-κB途径的调节中必不可少，然而目前肝脏损伤泛素化蛋白的鉴定及其调控机制还很不清楚。我们以串联泛素结合域为诱饵，在细胞中富集泛素化修饰的蛋白，并利用质谱技术对泛素化蛋白进行鉴定和定量。结果发现，qUBA可以大规模鉴定泛素化蛋白，特别是TNF-α /NF-κB途径中泛素化的信号转导蛋白。本项目拟在此基础上开展深入研究，利用急性肝脏损伤模型、qUBA泛素化蛋白富集、质谱鉴定及定量等技术，揭示肝脏急性损伤过程中肝脏内源泛素化蛋白的定量和动态变化。这项研究将发现与肝脏疾病相关的蛋白泛素化修饰组，建立泛素化修饰与肝脏损伤之间功能联系。为今后的功能研究奠定基础。

内毒素诱发的肝脏损伤与多种肝脏疾病密切相关，如参与酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、胆汁淤积和缺血-再灌注损伤等疾病的发生和发展，是诱导肝脏疾病的重要原因之一。TNF-α介导的肝细胞死亡是内毒素诱发肝脏损伤过程的主要-细胞生物学机制。研究表明，蛋白泛素化修饰在TNF-α/NF-kB途径的调节中起着至关重要的作用，然而，目前针对肝脏损伤过程中，泛素化修饰蛋白种类的鉴定及其调控机制研究甚少，另外，泛素化蛋白修饰作为一种TNF-α/NF-kB途径的重要调节形式，急需深度、大规模，且高通量的手段借以实施深层次的开发利用和研究。利用目前已经开发成熟的泛素化蛋白的富集技术，结合高通量的质谱鉴定手段，我们以串联泛素结合域（qUBA domain）为诱饵，对肝细胞内泛素化修饰蛋白进行了深度定性与定量。结果发现，qUBA诱饵能够大规模富集泛素化修饰蛋白，特别是对参与TNF-α/NF-kB调解途径中信号传导蛋白的泛素化形式有显著富集作用。项目中，借助本课题组开发的qUBA诱饵结合特异性抗体富集手段，与另一开发的高/低pH双反向液相分离串联质谱鉴定技术的联合运用，我们大大提高了泛素化修饰蛋白/位点的鉴定能力与效率。目前，细胞内源性泛素化蛋白的鉴定种类已经超过7,000种，泛素化位点的鉴定也超过20,000种；借此，我们描绘了肝脏正常生理状态下的信号通路网络，并完成了内毒素诱导小鼠急性肝损伤模型的建立与损伤细胞内的泛素化修饰蛋白的质谱鉴定。