Sidt2介导的自噬紊乱在其相关骨骼肌病中的作用及机制

The dysfunction of the autophagy has induced severe metabolic disorders. Recent research has indicated that lysosome membrane proein maybe involved in cell autophagy . Loss of the classical lysosomal membrane protein LAMP1/2 can directly induce autophagy disorders and disease. Sidt2 is a lysosomal membrane protein in our recent discovery. By deletion of Sidt2 gene, we found that animal skeletal muscle deleted Sidt2 have heavier damage / lesions, which similar to many skeletal disease clinically, showing a contraction of muscle fibers, swelling of the sarcoplasmic reticulum, sarcomere damage accumulation of a large number of heterogeneous body, relieve muscle weight and muscle weakness. By conditional deletion of Sidt2 gene in skeletal muscle specifically, at basis of the Flox-Cre system, we found that the skeletal muscle deleted Sidt2 have also shown severe lesions. Under electron microscope, we observed the pathological changes of muscle fiber accumulation of specific autophagy vesicles and increased expression of Atg7and LC3II, two keys of the autophagy. All of these suggesting that the myopathy were induced by autophagy dysfunction after Sidt2 deleted in skeletal muscle.So, the project intend to explore the possible mechanism of skeletal lesions in perspective of autophagy dysfunction / damage induction by Sidt2 deletion, and which will explore the relation between the lysosome membrane and autophagy, and provided the advising for some unknown skeletal muscle myopathy diagnosis.

自噬的紊乱（减弱、增强/障碍）往往导致严重的代谢疾病。近来研究表明溶酶体膜蛋白可能参与细胞自噬途径的调控。溶酶体膜蛋白LAMP1/2的缺失可以直接引起机体自噬功能紊乱而致病。Sidt2是我们前期新发现的溶酶体膜蛋白，全剔除Sidt2基因，我们发现Sidt2-/-小鼠表现出一种严重的骨骼肌病。其和临床上许多骨骼肌病相似，呈现出萎缩的肌纤维，肌浆网肿胀，肌小节破坏、大量异质体堆积，减轻的肌肉重量及肌力减退。利用Flox-Cre对骨骼肌选择性剔除Sidt2后，骨骼肌同样出现上述病变，并观察到肌纤维内堆积的特异性自吞噬泡，分子检测发现自噬关键分子Atg7和LC3II表达明显增高，提示其可能存在自吞噬功能紊乱。所以，项目拟从自吞噬功能紊乱/损害这一角度去探索Sidt2引发骨骼肌病损的可能机制，深化对溶酶体膜蛋白与自噬的相关性认识，并有助于指导我们深化对临床上一些不明的骨骼肌代谢疾病的发病机制认识。

目 的 ：通过构建Sidt2基因剔除小鼠模型，观察Sidt2剔除后对小鼠骨骼肌的影响，并探讨其具体的机制。方 法 ：运用Cre-loxp系统建立Sidt2基因条件性剔除小鼠模型，通过HE染色、PAS染色、COX染色、免疫荧光检测Laminin观察Sidt2剔除后骨骼肌的病理学改变，通过电镜观察Sidt2剔除后骨骼肌组织超微结构的变化。Western blot、免疫荧光技术在正常饮食，以及饥饿两种状态下检测自噬及自噬调控途径关键蛋白的变化，观察Sidt2缺失对骨骼肌自噬的影响。另一方面通过TUNEL染色检测sidt2敲除后骨骼肌的凋亡水平， Western blot检测凋亡的三条调控途径过程中的关键蛋白表达水平的变化，以及观察Sidt2剔除后对凋亡的影响。并且对线粒体和溶酶体的功能进行了检测。结 果：在成功获得了骨骼肌Sidt2剔除的小鼠模型并在DNA、RNA、蛋白水平鉴定造模成功的基础上。我们通过HE染色后在光镜下可以观察到Sidt2剔除组骨骼肌的变性、炎性浸润及肌纤维尺寸的缩小甚至肌纤维的萎缩；通过PAS染色后在光镜下可以观察到Sidt2剔除组骨骼肌存在着大量的糖原积累；通过COX染色后在光镜下可以观察到Sidt2剔除组骨骼肌细胞色素氧化酶明显减少；通过免疫荧光检测Laminin在Sidt2剔除组可观察到肌纤维尺寸的缩小，肌膜的异常；在电镜下可以看到Sidt2剔除组骨骼肌细胞的结构紊乱，线粒体的肿胀与堆积，大量的自体吞噬泡的堆积以及细胞核染色质的凝集与边集等大量病理改变。接着Western blot检测自噬关键蛋白发现Sidt2剔除组的自噬及其调控过程中的关键蛋白LC3II、P62、Beclin1、Atg12，mTOR、S6K1、Akt等均发生改变。饥饿诱导后自噬诱导阶段的关键蛋白P62、Akt、mTOR、S6K1等出现异常改变。LC3b双标实验sidt2敲除后仍能检测到绿色荧光，说明发现自噬体和溶酶体融合障碍。同时通过TUNEL试剂盒检测凋亡，发现Sidt2剔除组的骨骼肌凋亡明显增加。Western blot检测凋亡途径的关键蛋白发现Sidt2剔除组的Caspase3、Caspase9、Caspase12、Chop、Bip、P-eif2a、P-perk、ATF6、Bax、Bad等关键蛋白的表达含量增加此外在对sidt2敲除后的肌细胞溶酶体和线粒体均发生异常改变。