肝癌胚胎抗原Glypican-3纳米疫苗递送系统的设计及其在肝癌免疫治疗中的应用

The aim of the project is to prepare hepatocellular oncofetal antigen loaded nanoparticles with DC targeting effect, photosensitivity and pH sensitivity for liver cancer immunotherapy. Mannose, pheophorbide-A and glypican -3 (GPC-3) modified triblock copolymer PEG-PPG-PEG were used as emulsifier with DC targeting effect, photosensitivity and pH sensitivity. polyethyleneimine (PEI) modified poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) was choosed as carrier material, GPC-3 loaded nanoparticles were preparation using double emulsion solvent evaporation method. After subcutaneous administration, GPC-3 loaded nanoparticles could be uptake by DC via mannose receptor-mediated endocytosis. The track of DC migration with GPC-3 loaded nanoparticles is studied using near infrared imaging. GPC-3 antigen coupling on the surface of GPC-3 loaded nanoparticles with pH sensitive C=N bond could initial burst release in endosome/lysosomes low pH environment, while GPC-3 loaded in the core of GPC-3 loaded nanoparticles was sustained release. The endo-lysosomal membranes could be destruction by the reactive oxygen species (ROS) generated from activated photosensitizers collaborative PEI proton sponge effect. And then, GPC-3 antigen could be released into the cytoplasm for antigen cross presentation. CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T lymphocyte could be simultaneous activated for liver cancer immunotherapy.

本项目拟制备一种具有树突状细胞（DC）靶向性、内涵体逃逸特性，能够将包载的肝癌胚胎抗原缓-控释放的可示踪纳米粒子，应用于肝癌免疫治疗。以甘露糖、脱镁叶绿酸盐-A和肝癌胚胎抗原（磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，GPC-3）修饰三嵌段共聚物PEG-PPG-PEG，分别制备具有DC靶向性、光敏性和可示踪功能，以及pH敏感的乳化剂，以聚乙烯亚胺修饰PLGA为载体材料，采用双乳化-溶剂挥发法制备包载GPC-3纳米粒子，皮下给药后，此纳米粒子可通过甘露糖受体介导的内吞方式被DC包吞，通过活体成像可示踪纳米粒子随DC迁移过程，纳米粒子进入DC内涵体/溶酶体，在较低pH环境下，纳米粒子表面以pH敏感键C=N偶联的抗原突释，内部包载的抗原缓释，在体外激光刺激下，光敏剂产生ROS，协同PEI“质子海绵效应”抗原可实现内涵体逃逸，进行抗原交叉呈递，同时激活CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞，进行肝癌免疫治疗。

纳米疫苗可提高以树突状细胞（DC）为肿瘤疫苗核心的特异性肿瘤免疫治疗效率。本项目主要围绕纳米疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用展开研究工作。通过对纳米材料结构的设计，制备具有DC靶向性、内涵体逃逸特性，能够将包载的抗原缓-控释放的纳米疫苗，以提高DC对抗原的摄取量，促进抗原交叉呈递，进而提高肿瘤免疫治疗效果。. 为了提高DC对抗原的摄取量，本项目通过在纳米疫苗表面修饰能与DC特异性结合的甘露糖靶向配体，以增加DC对抗原的摄取量，通过对天然多糖海藻酸钠进行化学改性，分别制备了具有DC靶向性的甘露糖修饰海藻酸钠和具有pH敏感性的抗原修饰的海藻酸钠，共混并采用离子交联法制备具有DC靶向性和pH敏感性的纳米疫苗，可明显增加DC对抗原的摄取量，延长抗原在淋巴结驻留时间，提高肿瘤免疫治疗效果。. 为了促进抗原交叉呈递，本项目将光化学内化技术引入纳米疫苗。我们将光敏剂修饰到载体材料聚乙烯亚胺上，再通过静电相互作用，制备了光敏性纳米疫苗，利用特定波长光照激活分布在内涵体/溶酶体膜上的光敏剂产生活性氧，破坏内涵体/溶酶体膜，实现内涵体/溶酶体逃逸，促进抗原交叉呈递，提高了CD8阳性T细胞比例，增强肿瘤免疫治疗效果。. 为了考察纳米疫苗对肝癌的免疫治疗效果，本项目制备了抗原和佐剂共递送纳米疫苗。以海藻酸钠和聚乙烯亚胺为载体材料，以肝癌特异性多肽抗原GPC3127-136肽（GPC3127-136，AMFKNNYPSL）为免疫抗原，以CpG寡脱氧核苷酸（CpG）为佐剂，通过静电相互作用制备了抗原和佐剂共递送纳米疫苗，在体外和体内均能促进DC成熟，增强对肝癌细胞的杀伤效果。. 我们的研究结果表明：1）甘露糖修饰纳米疫苗可增加DC对抗原摄取量; 2）采用光化学内化技术，通过体外激光刺激，可提高CD8阳性细胞毒性T淋巴细胞比例;3)同时负载抗原和免疫佐剂的纳米疫苗可提高肿瘤免疫治疗效果。本项目工作已发表SCI收录科研论文4篇，申请中国发明专利2项（均为第一发明人）。