猪细胞重编程和早期胚胎发育关键母源内源性小干扰RNA的挖掘与功能研究

Maternal factors stored in oocytes have critical roles in nuclear reprogramming and early embryonic development, therefore, identification and characterization of maternal factors will be of great significance to developmental biology. Comparing the protein profiles of porcine oocytes with different reprogramming and developmental abilities, we have identified maternal proteins by classical methods of quantitative proteomics 2D-PAGE. Except proteins, endo-siRNA is one of the major maternal factors. In the study, we will construct the small RNA profile of porcine MII oocytes to identify maternal endo-siRNA, and demonstrate its roles in fertilization, chromosome remodeling, epigenetic modification, regulation of pluripotent gene, genomic imprinting, zygotic genome activation, embryo compaction, cell differentiation and other processes. The profile will provide comprehensive knowledge of maternal factors in porcine oocyte and lay a good foundation for clarification the function of maternal endo-siRNA on nuclear reprogramming and early embryonic development.

卵母细胞具有大量能促进细胞重编程和早期胚胎发育的母源因子。母源因子的鉴定和功能解析是发育生物学领域的研究热点。在本课题组的前期工作中，我们通过建立重编程和发育能力不同的猪MII期卵母细胞的差异蛋白表达谱，获得了一批可能在细胞重编程和早期胚胎发育过程中发挥作用的母源蛋白。除了蛋白质以外，endo-siRNA也是一类重要的母源因子。据此，本研究拟通过小RNA深度测序技术构建上述猪MII期卵母细胞模型的小RNA图谱，挖掘母源endo-siRNA，并通过其对靶基因表达的调控，深入探讨endo-siRNA在受精、染色质重塑、表观遗传修饰、多能性基因调控、印迹基因维持、合子基因组激活、胚胎致密化和细胞分化等多个生物学事件中的作用。相信本研究将会促进人们对猪MII期卵母细胞中母源因子的全景式认识，为阐述母源endo-siRNA的功能以及全面解析哺乳动物细胞重编程和早期胚胎发育奠定良好的基础。

在哺乳动物细胞卵母细胞中存在大量的小RNA分子，这些小RNA分子在基因表达调控过程中具有重要作用。近些年新发现的内源小干扰RNA（endo-siRNA）就是其中一种。Endo-siRNA是新兴的生命科学领域研究热点，其在哺乳动物早期胚胎发育过程中发挥着重要调控作用，但目前为止，endo-siRNA的研究还仅限于小鼠，在其它哺乳动物中存在很大空白。猪作为最重要的大型哺乳动物生物医学模型，其生殖发育调控研究对人类生殖发育生理和病理过程研究具有重要参考价值。据此，本课题首先利用LNA-RNAi技术在猪GV期卵母细胞中敲低Dicer、Dgcr8和Drosha，发现Dicer干扰组成熟率与阴性对照组比显著下降，而Dgr8和Drosha干扰组与阴性对照组无显著差异。经体外受精，绝大部分Dicer干扰组的胚胎都阻滞在1-细胞期，2-细胞率显著低于阴性对照组，而Dgr8和Drosha干扰组与阴性对照组无显著差异。另外，我们通过小RNA高通量测序技术在猪卵母细胞、精子和合子中鉴定了大量的endo-siRNA，其形成来源包括转座子、长发卡和自身互补的mRNA。进一步，我们研究了合子中大量存在的Line1相关endo-siRNAs的功能，并证明L1-siRNAs能通过抑制Line1的逆转录活性调控猪胚胎早期发育。综上，我们得到结论：endo-siRNA在卵细胞和合子中大量存在，其在卵母细胞成熟和胚胎早期发育过程中起着很重要的作用。相信本研究将会促进人们对猪卵母细胞和早期胚胎中endo-siRNA的全景式认识，为阐述母源endo-siRNA的功能以及全面解析哺乳动物早期胚胎发育奠定良好的基础。