糖耐康干预糖尿病小鼠肾小管上皮细胞转分化研究

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见的微血管并发症之一。在美、日和欧洲等发达国家和地区，DN已成为终末期肾脏疾病的首因（约占35%）和糖尿病患者死亡的主要原因，在我国这一比例也逐年上升（约占10%）。目前，西药治疗DN尚缺乏有效手段，中医药在这方面积累了丰富经验，特别是对早期DN取得了较好的疗效，其科学内涵亟待阐明。DN发病机制尚不清楚，但研究发现转化生长因子β1（TGF-β1）在DN的发生发展中起着非常重要的作用。本项目拟利用携带活性TGF-β1的腺病毒载体，通过自发性2型糖尿病模型KK-Ay小鼠构建无明显炎症反应的肾纤维化模型，围绕肾小管上皮细胞转分化机制中有待探索的热点问题-TGF-β1/Samds信号转导途径与肾小管上皮细胞转分化的关系，探讨临床有效中药"糖耐康"防治糖尿病肾间质纤维化的作用靶点及机制，解决中医药防治DN关键科学问题，为中药防治DN的研究提供新思路和新方法。

目的：本项目通过观察中药糖耐康干预肾小管上皮细胞转分化的实验研究，探讨糖耐康干预糖尿病肾病肾间质纤维化的作用及机制，为其防治肾间质纤维化的临床应用提供实验依据。.方法：（1）50只雄性 KKAy小鼠，按随机血糖值随机分为：模型组、糖耐康高、中、低剂量组及缬沙坦组，每组10只；健康雄性C57BL/6J小鼠10只为正常组。糖耐康高、中、低剂量组分别以4.56g/kg.d，2.28g/kg.d，1.14g/kg.d浓度按0.01ml/g体重灌服糖耐康水溶液，缬沙坦组按0.46mg/kg.d灌服缬沙坦水溶液，正常组和模型组灌服等体积生理盐水。每日1次，连续给药8周。记录小鼠一般情况、体重、血糖，实验周期结束时，测定小鼠血清血糖、胰岛素、甘油三酯、总胆固醇、尿素氮、和肌酐、水平，做肾组织HE染色、Massom染色和PAS染色并进行图像分析；免疫组化法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白、、E-钙粘蛋白；Real-time PCR检测肾TGF-β1 mRNA、TGF-β R1 mRNA、TGF-βR2 mRNA、Collagen I mRNA、Collagen Ⅲ mRNA和FN mRNA表达；wetern blot检测肾TGF-β1、Smad2，P-smad2，Smad3，P-smad3，Smad7蛋白表达。.（2）HK-2 细胞用含 10 % 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素 DMEM/F12（1:1）完全培养基，于 37 ℃、5% CO2 细胞培养箱中传代培养。细胞分为6 组：（1）空白对照组：DMEM/F12 培养液；（2）单纯TGF-β诱导组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1；（3）空白血清对照组：DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+10%空白血清；（4）干预1组：DMEM/F12 培养液+10 ng/mL TGF-β1 +5%糖耐康含药血清；（5）干预2组：DMEM/F12 培养液+10 ng/mL TGF-β1 +10%糖耐康含药血清；（6）干预3组：DMEM/F12 培养液+10 ng/mL TGF-β1 +20%糖耐康含药血清，然后观察细胞形态、检测细胞增殖、免疫组化法检测肾组织α-平滑肌肌动蛋白、E-钙粘蛋白；Real-time PCR和 wetern blot检测指标同动物实验部分。.结果：（