PTHrP-IHH信号通路对梅花鹿茸角再生的调控

鹿茸角是哺乳动物唯一的一个在失去后还能完全再生的器官。本课题以梅花鹿为研究对象，通过原位杂交、RNA印迹、荧光定量RT-PCR、免疫蛋白印迹及免疫组织化学等方法对PTHrP-IHH信号通路中起关键作用的分子如PTHrP、PPR、Sox9、IHH及Smo mRNA和蛋白在生茸骨膜及不同生长阶段茸角内的表达进行研究，探讨这些分子在梅花鹿茸角内的表达与茸角再生的关系；分离鹿茸间充质细胞及软骨细胞，研究PTHrP及IHH对间充质细胞及软骨细胞生长行为的影响；通过RNA干扰技术阻断PTHrP及IHH的表达，研究PTHrP及IHH调控的一些分子在鹿茸间充质细胞及软骨细胞内表达的变化，揭示PTHrP-IHH信号通路对梅花鹿茸角再生的调控机理。这些研究结果将为探明鹿茸角发育与再生的分子机理、鹿茸产量的提高、哺乳动物器官再生及创伤修复动物模型的建立、充分开发和利用我国的梅花鹿鹿茸资源等提供重要的理论依据。

本研究通过原位杂交方法对PTHrP及其受体PPR在梅花鹿茸角内的表达进行了研究。结果表明，PTHrP和PPR在鹿茸皮肤层、软骨膜层、间充质层和软骨中均有表达，且在鹿茸真皮层的成纤维细胞和软骨细胞中表达量较高，提示PTHrP可能在鹿茸软骨细胞分化过程中发挥重要的调节作用。为了进一步证实PTHrP的作用，我们分离培养了鹿茸软骨细胞，并通过甲苯胺蓝染色和Col II免疫细胞化学染色对其进行了鉴定，在软骨细胞中添加PTHrP（1-34）后，前肥大软骨细胞标志分子Col IX和肥大软骨细胞标志分子Col X的表达受到了明显的抑制，提示PTHrP可抑制鹿茸软骨细胞向肥大软骨细胞分化。为了进一步研究PTHrP在鹿茸软骨细胞分化过程中的作用机制，我们通过原位杂交方法检测了Cyclin D1、Runx2、Bcl-2、MMP9和MMP13在梅花鹿茸角内的表达，结果发现，这些基因在鹿茸软骨细胞中均高表达。在鹿茸软骨细胞中，PTHrP通过PKA和PKC通路来促进Cyclin D1的表达；通过PKA、p38MAPK、MEK和PI3K通路来抑制Runx2的表达；通过PKA、p38MAPK和MEK通路来促进Bcl-2的表达；通过JNK通路来抑制MMP9的表达；通过p38MAPK和PKC通路来抑制MMP13的表达。同时，我们也通过原位杂交方法对IHH在茸角内的表达进行了研究。结果发现，IHH在梅花鹿茸角中的表达模式与PTHrP相似，也高表达于鹿茸软骨细胞中。在鹿茸软骨细胞中，IHH可促进Col II的表达，而抑制Col IX和Col X的表达。为了进一步了解IHH在鹿茸软骨细胞分化过程中的作用机制，在鹿茸软骨细胞中添加100 ng/ml IHH后，检测了IHH下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2和Runx2的表达变化，结果发现IHH可促进Cyclin D1和Bcl-2的表达，而抑制Runx2的表达。此外，我们也检测了Sox4、Sox5、Sox6、Sox9、Ptc和Smo在梅花鹿茸角内的表达，发现这些基因表达于鹿茸真皮层的成纤维细胞、软骨膜细胞、间充质细胞和软骨细胞中，且在鹿茸软骨细胞和真皮层成纤维细胞中表达量较高。综上所述，PTHrP和IHH可通过Cyclin D1、Bcl-2、Runx2、MMP9和MMP13等基因来抑制鹿茸软骨细胞的分化，从而调控鹿茸的再生过程。