M、B细胞双靶向修饰防龋DNA纳米疫苗的研制及其黏膜免疫反应机制研究

粘膜免疫是机体抵御多种疾病的首要屏障，sIgA是预防龋病的特异效应分子。M细胞在粘膜抗原摄取和sIgA产生中发挥重要作用，记忆性B细胞是生成大量、长效抗体的关键。因此，本课题利用FimH特异性靶向M细胞、DOCK8促进记忆B细胞活化，制备了双靶向的防龋DNA纳米疫苗，增强防龋粘膜免疫效果。首先，构建FimH和DOCK8表达质粒并检测基因表达及生物学功能。其次，以壳聚糖包裹FimH、DOCK8及防龋DNA疫苗成纳米微粒，检测其经粘膜免疫诱导特异性抗体水平、免疫类型与强度，评价防龋保护能力。最后，分析FimH/DOCK8对M/B细胞基因表达的影响，检测该疫苗免疫对接种局部粘膜相关淋巴组织的细胞组成与微环境的影响，系统深入地探讨FimH/DOCK8增强防龋DNA粘膜免疫效果的可能机制。这样，为免疫防龋理论提供新的实验依据，为其它经粘膜感染疾病（艾滋病、流感等）的疫苗研发提供新的思路和方法。

该项目主要探讨了与疫苗粘膜免疫相关的二个重要科学问题，分别研制针对粘膜免疫中发挥重要作用的M细胞（抗原摄取和递呈）和B细胞（长效抗体产生）的分子佐剂，探索其单独或协同增强防龋疫苗粘膜免疫效能作用及机制。本项目以项目任务书为指导原则和基础，完成了M细胞特异性靶向分子FimH的原核表达纯化及其对M细胞和DC细胞免疫活性效应评价；成功构建了与B细胞活化相关的Dock8真核表达质粒及病毒载体表达质粒；以壳聚糖粘膜递呈系统制备了靶向M细和B细胞的防龋纳米疫苗，进行了以FimH和Dock8为分子佐剂增强防龋DNA\蛋白疫苗的特异性抗体水平，延长抗体持续时间和减少龋齿发生的保护效应的免疫效能评价，并从FimH和/或 Dock8对在疫苗免疫应答中发挥重要作用的M细胞、树突状细胞（DC）和B细胞的功能调节，以及其对机体免疫反应类型调节等细胞和分子水平探索其增强免疫效能的相关机制。研究结果提示研制成功了特异性靶向M细胞的FimH分子佐剂，有效增强防龋DNA疫苗及蛋白亚单位疫苗的粘膜免疫效应，证明FimH不仅特异性与M细胞GP2结合促进M细胞的摄取，而且能通过PRRS活化DC，促进DC向Th2型活化继而促进抗体的产生。目前未见M细胞特异性靶向分子佐剂的研究报导。同时研制FimH/CS/DNA防龋纳米微粒，能增强防龋疫苗的粘膜粘附性、转染效率及有效控释，为新型防龋纳米疫苗的研发奠定基础。.本课题截止结题日，发表标注本基金项目的SCI论文2篇，中文论著3篇，综述1篇，培养5名研究生，其中1名博士和1名研究生已毕业。专利申请和后续SCI论文的发表正在进行中。