原生动物盘基网柄菌尿囊酸酶功能及其与gp150蛋白相关性的研究

盘基网柄菌多细胞发育过程有着严格的时间和空间的发育程序，是众调控因子协调作用的结果。研究尿囊酸酶及其相关蛋白在盘基网柄菌多细胞发育和细胞增殖中的作用，搞清尿囊酸酶干扰细胞发育停留在早期细胞丘阶段的原因及其对发育的调控作用，搞清尿囊酸酶位置与细胞发育和分化的关系。搞清尿囊酸酶与其相关蛋白的关系，分析和鉴定这些相关蛋白，重点研究与gp150蛋白的关系，弄清两者关系在发育调控途径中所起的作用。搞清尿囊酸酶干扰细胞增殖能力增强的原因，重点研究RasD和RasG在细胞周期调控中作用，了解盘基网柄菌细胞周期调控机制。所得结果对认识尿囊酸酶对盘基网柄菌多细胞发育的调控功能，蛋白间相互作用对细胞发育和分化的影响，了解盘基网柄菌细胞周期及调控机制，对探讨低等真核生物细胞分化和增殖机制有重要作用。

用免疫荧光技术观察盘基网柄菌野生型细胞，在细胞聚集阶段，尿囊酸酶多存在于细胞膜附近；在细胞丘阶段，细胞丘外层细胞中荧光较强；在蛞蝓体阶段，尿囊酸酶在前柄细胞中的表达量明显多于前孢子细胞；在子实体成熟过程中，前柄细胞区与前孢子区交界处荧光最强，该区域内细胞将分化成前柄细胞B。提示酶定位表达与细胞类型分化有关。在野生型细胞发育过程中，尿囊酸酶的表达量呈现逐渐上升的趋势，发育18h达到最大值；gp150蛋白突变细胞中酶的表达量始终较低，表明gp150的缺失影响了尿囊酸酶的表达。用gp150 蛋白抗体共沉淀，成功分离出两个与gp150蛋白相互作用的蛋白质，鉴定为40S核糖体蛋白S3（RPS3)和40S核糖体蛋白S24(RPS24)，两蛋白在细胞周期调控、细胞发育及凋亡过程中有重要作用。提示在盘基网柄菌多细胞发育中gp150蛋白可能与rpS3和rpS24发生相互作用，借此调节了细胞分化和发育。用尿囊酸酶抗体共沉淀，亦分离出rpS3。野生型细胞中，尿囊酸酶与lagC在多细胞发育阶段的表达趋势相同，两基因在达到最大表达量后，分别开始下降；而rpS3表达量总体呈下降趋势。在突变细胞AK127和RNAi-allC中，各基因的表达量均低于野生型细胞，且无明显变化趋势，仅在相对较低的范围内波动。各基因在多细胞发育阶段的表达情况明显不同，缺失lagC和干扰allC后对相关的基因表达产生了影响。Western blot结果表明尿囊酸酶在前柄细胞中的分布多于前孢子细胞中，与gp150分子的分布情况一致，进一步提示尿囊酸酶参与细胞分化，且与gp150分子关系密切。allC，lagC和rpS3之间存在某种相互作用，共同调节盘基网柄菌的细胞发育和分化。用胶体金免疫电镜技术研究发现细胞聚集期细胞的尿囊酸酶主要分布于线粒体及周围的细胞质内。细胞丘时期，尿囊酸酶存在于发生内自噬的线粒体内，并特异性地局限于内自噬产生的空泡内。这些细胞将分化成千孢子细胞。随前孢子细胞分化的进行，酶颗粒逐渐减少，在靠近质膜处还存在一些酶颗粒。另一些细胞内，几乎所有的胞器内都能观察到酶颗粒，一直延续到柄细胞形成。因此尿囊酸酶在将发育成孢子细胞和柄细胞两种类型细胞内的分布位置完全不同，提示尿囊酸酶蛋白与盘基网柄菌细胞分化和凋亡途径有密切关系。结果提示尿囊酸酶与gp150蛋白、rpS3和rpS24相互作用，共同调控细胞的发育与分化。