基于螺吡喃结构互变的比率型双光子探针设计及肝脏中碱性磷酸酶表达水平分析

Two-photon probe with such properties as deeper penetration depth, avoidance of photodamage and photobleaching, imaging in the black background, is becoming a powerful tool for bioanalysis. ALP, as a hydrolase enzyme responsible for removing phosphate groups from many types of molecules, plays an important physiological function in biological system. In order to solve the lack of performance of two-photon probe and the problems of detection of ALP in biomedical field, in this project, a new class of two-photo compounds, combinning the two-photon characteristic of carbazole and structure tautomeric characteristic of spiropyran, will be poposed and synthesized. Based on the principle of the structure conversion of spiropyran moiety from open form to closed form, a new ratiometric two-photon probe will be designed for ALP detection. In the presence of ALP, the two-photo signal will shift because of the change of conjugated system. Meanwhile, as a further application, the probe will be used to detect endogenous ALP in living liver cells and tissues. The distribution and express level of ALP will be investigated by real-time microscopy imaging. This project will achieve the following objectives: propose a new strategy for two-photon design, promote the development of ALP fluorescent probe, make a deeper understanding the physiological and pathological processes ralated with ALP, provide evidence for the early diagnosis and efficacy evaluation of related diseases with ALP.

双光子探针由于其对组织穿透能力强、损伤小、能有效的避免生物背景荧光的干扰等优点，在生物分析中具有极大的应用前景。本项目针对目前双光子探针性能的不足，以及发挥重要生理功能的碱性磷酸酶（ALP）在生物医学检测中存在的问题，首先拟结合螺吡喃结构互变特性和咔唑双光子性能，通过共价交联合成新型的双光子荧光团，然后基于螺吡喃开环体向闭环体异构引起共轭体系改变的设计思路设计比率型双光子探针，通过ALP激活螺吡喃的结构互变，实现双光子信号转变，建立复杂体系中ALP高灵敏和高选择性的检测方法，并通过肝细胞和肝脏组织中ALP的实时成像研究，分析其在细胞组织内的分布以及活性表达水平。本项目的完成将提出双光子探针设计的新策略和新方法，促进ALP荧光探针的发展，加深对与ALP相关生理和病理过程的了解，为相关疾病的早期诊断与疗效评价提供方法和手段。

近年来，双光子技术的发展为生物医学研究者在组织和活体样本分子影像研究方面提供了极大的便利，具有广阔的应用前景。但是目前开发出来的双光子荧光探针普遍存在吸收截面小、量子产率低，以及单一波长信号等问题，致使很难实现复杂生物体系中待测物的准确检测。为了较为有效的处理这些问题，本项目拟通过结合可产生结构互变异构的螺吡喃与具有一定双光子特性的咔巴唑，设计合成吸收截面大、量子产率高的新型双光子荧光团，并基于螺吡喃开环体向闭环体异构的设计思路，构建一个比率型双光子传感平台，并开发出碱性磷酸酶活性检测的比率型双光子探针。但是在合成该探针的过程中，发现目标产物及其不稳定，在提纯过程中就发生了变质，致使项目初期设计的探针结构不能被应用于样品检测，因此，在不改变本项目整体思路的前提下，我们通过采用具有优良双光子特性的石墨烯量子点替换咔巴唑，通过将螺吡喃结构共价修饰至量子点上，由于石墨烯量子点的发射波长与螺吡喃的激发波长能发生比较好的重叠，从而构建了一个基于FRET原理的比率型双光子传感平台。并在螺吡喃结构中引入过氧化氢（H2O2）的识别位点，当在检测H2O2的过程中，螺吡喃结构发生开环体向闭环体的异构，螺吡喃荧光减弱，量子点荧光增强，从而实现比率型信号的输出。本体系成功的应用于组织和活体中H2O2的成像分析。因此，本项目的开展提出了双光子探针设计的新策略，并为进一步了解H2O2相关生理与病理方面的功能提供了有效的分子工具。另外， 在本项目的资助下，完成了多例双光子/近红外探针的设计与应用研究，并成功构建了多种基于分子组装技术的分子纳米探针。