DNA修复蛋白及其基因启动子甲基化与涎腺腺样囊性癌化疗耐药性研究

涎腺腺样囊性癌化疗敏感性差是导致患者远期生存率低的因素之一。DNA修复蛋白及其基因启动子甲基化状况与肿瘤化疗耐药相关，抑制DNA修复蛋白可以提高化疗敏感性。本研究拟利用甲基化特异性PCR（MSP）、DNA测序、免疫组织/细胞化学等方法检测人涎腺腺样囊性癌组织标本、体外培养细胞中DNA修复蛋白MGMT、hMLH1的启动子甲基化状况、蛋白表达，分析二者蛋白表达与甲基化的相关性及其与临床病理指标的关系；用MGMT抑制剂、去甲基化剂处理体外培养肿瘤细胞、移植瘤，MSP、RT-PCR、生化检测、肿瘤大小检测等分析处理前后肿瘤MGMT、hMLH1启动子甲基化、mRNA、蛋白活性以及对烷化剂、铂类药物敏感性的变化。研究将从DNA修复通路的表遗传改变这个新的角度对腺样囊性癌的化疗耐药机制进行探索，研究结果将为该肿瘤的化疗药物选择、预后及疗效预测、抑制DNA修复作为提高化疗效果的潜在辅助治疗手段提供新思路。

唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）化疗敏感性差是导致患者远期生存率低的因素之一。本研究分别对腺样囊性癌患者的临床病理特征进行了分析，利用免疫组织化学和甲基化特异性PCR（MSP）的方法检测51例未经放化疗的原发病例的组织学标本中hMLH1、MGMT蛋白表达水平及基因启动子甲基化状况。应用MSP和Western blot法检测体外培养的腺样囊性癌细胞系SACC-83和SACC-LM中hMLH1、MGMT启动子甲基化状况及其蛋白表达情况。应用甲基化转移酶抑制剂Decitabine（DAC）、顺铂、MGMT抑制剂O6-苄基鸟嘌呤（O6-benzylguanine，O6-BG）及氮芥处理体外培养的SACC-83和SACC-LM肿瘤细胞后，检测四种药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50。Real Time PCR、Western blot法和流式细胞技术法检测用药前后SACC-83和SACC-LM细胞mRNA、蛋白表达及细胞周期和凋亡的变化。MTT法分别检测DAC、顺铂与O6-BG、氮芥单独/联合使用时活细胞数量的变化。利用SACC-83细胞建立荷瘤鼠模型，DAC和顺铂单独/联合处理荷瘤鼠模型，测量肿瘤大小变化。研究结果显示：普通化疗不能改善腺样囊性癌患者的生存率。51例SACC组织标本中hMLH1的表达与组织学分级、TNM分期显著相关（P＜0.05），MGMT的表达与组织学分级显著相关（P＜0.05）；28例（55%）检测到hMLH1基因启动子甲基化，3例（6%）检测到MGMT的甲基化。SACC-83和SACC-LM中存在hMLH1基因启动子甲基化，同时检测到hMLH1蛋白表达。DAC处理细胞前后hMLH1 mRNA和蛋白表达水平有明显变化，用药后细胞周期S期明显阻滞， DAC和顺铂与O6-BG和卡氮芥联合应用比分别单独使用时活细胞数量明显减少。DAC、顺铂单独/联合处理荷瘤鼠模型发现，两种药物联合使用肿瘤体积小于两种药物单独使用。本研究结果表明，腺样囊性癌对普通化疗药物不敏感，hMLH1的高表达与患者预后差相关。通过抑制DNA修复蛋白和活性可增加腺样囊性癌细胞对化疗的敏感性，抑制肿瘤的生长。研究结果为这一肿瘤的化疗药物选择、预后及疗效预测、抑制DNA修复作为提高化疗效果的潜在辅助治疗手段提供新思路。