精氨酸甲基转移酶PRMT1调控牙发育的机制研究

Molecular mechanism during tooth development is the key step in tooth regeneration engineering, which can provide theoretical basis and technical support. However, the current regulatory mechanisms of the late stage in tooth development are still unclear. PRMT1 is the most important arginine methyltransferase, which controls the majority of protein arginine methylation, thereby performing epigenetic regulation of signaling pathways. Our team reported that PRMT1 is essential for the initiation of BMP signaling. And our preliminary data reveal that PRMT1 regulates tooth germ mineralization. We hypothesized that PRMT1 in dental mesenchyme regulates BMP signaling pathway through methylation of BMP pathway regulator, Smad6, thereby regulating tooth development. Therefore, this project intends to construct a mouse strain with conditional knockout of PRMT1 in neural crest cells to study the mechanism by which PRMT1 regulates early stage of tooth development. A mouse strain with inductively conditional knockout of PRMT1 will be constructed to investigate the function of PRMT1 on late stage of tooth development, particularly tooth mineralization and tooth root formation. The successful implementation of this project will reveal the mechanism of PRMT1-mediated arginine methylation on tooth development and lay the foundation for tooth regeneration based on PRMT1 regulation mechanism.

牙发育过程中的分子调控机制是牙再生工程中的关键研究环节，可以为牙再生提供理论基础和技术支持，然而晚期牙发育的调控机制尚不明确。PRMT1是最重要的精氨酸甲基转移酶，控制大部分蛋白质底物的精氨酸甲基化，从而进行信号通路的表观遗传调控。课题组此前报道过PRMT1调控BMP信号通路的激活。课题组前期研究发现PRMT1调控牙胚矿化。我们推测在牙发育过程中，牙胚间质细胞中PRMT1可能通过BMP通路调节因子Smad6的甲基化实现对BMP通路的调控，从而调控牙发育。因此，本项目拟用已构建的神经嵴细胞条件性敲除PRMT1小鼠品系，研究PRMT1调控早期牙发育的机制。同时使用诱导性条件性敲除PRMT1品系，研究PRMT1对晚期牙发育，特别是牙胚矿化、牙根形成的调节机制。该项目的顺利实施将揭示PRMT1介导的精氨酸甲基化对牙发育的影响及机制，为基于PRMT1调控机制的牙再生奠定基础。

颅神经嵴细胞来自面部的神经管（前脑、中脑、后脑），在面突和咽弓分布广泛，最终分化成典型的神经嵴衍生物，例如颅颌面部的牙，骨骼、颅神经节和纤维结缔组织。神经嵴的形成是一个多通路参与介导的复杂过程，参与包括 BMP、WNT 和 FGF 信号通路。而 BMP 信号通路被广泛视作神经嵴形成的关键通路。而PRMT1介导的精氨酸甲基化是调控颅颌面发育的关键，PRMT1 调控 BMP、WNT、TGF-β等路面发育关键信号通路。蛋白质精氨酸甲基化是真核生物中一种广泛存在并在进化上保守的蛋白质翻译后修饰。PRMT1 可以催化抑制型Smad6，在神经嵴衍生细胞即间充质细胞中，PRMT1 同时调控BMP 信号通路激活。神经嵴细胞中特异性敲除 PRMT1 后，颅骨中的 MSX1 信号减弱，MSX1是BMP的下游信号。来源于神经嵴细胞的腭突间充质细胞在敲除 PRMT1 后，p-smad1/5/9的含量明显被抑制。.本研究完善了PRMT1 mRNA 和蛋白质在牙胚及颅颌面骨及骨缝中的表达谱，通过体外牙胚组织器官培养以及转基因小鼠分别于离体及在体水平证明PRMT1在牙齿发育及颅骨发育过程中诱导分化的功能，通过组织形态学分析及体外细胞免疫荧光实验，流式细胞技术，ALP/ARS染色等探究PRMT1缺失时，胚胎时期神经嵴细胞迁移情况，牙乳头细胞及颅骨间质细胞的增殖、凋亡和分化等细胞行为学变化，结果发现PRMT1缺失后，牙乳头DPC细胞及小鼠颅缝来源前成骨细胞 MC3T3-E1的增殖能力，早期成骨分化及晚期矿化能力下降。后续通过Western blot，细胞免疫荧光实验并联合组学测序等进一步研究PRMT1敲减后，牙乳头发育及骨缝发育受阻的分子机制。结果显示分化诱导4天，7天后，p-smad1/5/9表达及H3R4me2a表达减弱，推测PRMT1通过BMP-Smad通路以及组蛋白调控影响神经嵴衍生细胞DPC及MC3T3-E1的分化，RNA测序结果提示PRMT1通过细胞周期及细胞干性调控相关信号通路影响MC3T3-E1分化能力。本研究该理论的提出为颅颌面发育及牙发育过程提供了新的理论基础，同时为颅颌面再生及颅颌面畸形的分子治疗提供理论基础，进一步为颅颌面疾病的预防、治疗和颅颌面组织再生提供策略依据。