香蕉束顶病毒DNA2编码基因特征及其分子调控机制研究

香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus, BBTV）是一种引起香蕉毁灭性病害的病毒。作为香蕉束顶病毒属(Babuvirus)的唯一成员，其基因组由6个约1kb大小的环型ss DNA组成，其中DNA2组分编码基因特征及所编码蛋白的作用缺乏研究。本项目对BBTV海南两个分离物进行了全基因组序列分析，发现DNA2组分核苷酸序列与国外分离物具有明显差异。在此基础上，拟通过分子杂交、RACE等手段明确该分离物DNA2编码基因的结构特征；通过酵母单杂交手段找到与DNA2组分调控蛋白及其结合位点；同时通过酵母双杂交、体外结合试验等手段寻找病毒侵染香蕉组织中与DNA2编码蛋白互作的功能蛋白。通过基因序列分析、生物信息学预测以及进一步对互作蛋白或其复合物晶体进行分子解析等手段，分析BBTV DNA2组分及其编码蛋白的结构和作用机制，为阐明BBTV侵染、复制和致病分子机理奠定理论基础。

香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）是一种多组分单链DNA基因组病毒，含有6个1kb左右环状DNA分子组分，分别编码6-8种不同功能的蛋白，其中DNA2（DNA-U3）组分在BBTV不同分离物中序列变异较大，编码基因结构和功能不详，仅有报道澳大利亚分离物（BBTV-Aus）存在编码89个氨基酸的10kd大小蛋白的转录物，但在一些亚洲分离物中都没有发现对应序列存在。本项目对海南获得的10个以上BBTV分离物进行基因组分析基础上，通过3’和5’RACE实验明确有一个229nt的转录物来自BBTV DNA-U3，预测编码一个31个氨基酸的小蛋白，该蛋白C端和BBTV-Aus DNA-U3编码的89个氨基酸的蛋白同源，N端缺失了58个氨基酸。序列分析表明该编码基因由GUG作为起始密码，在GenBank数据库中49个BBTV DNA-U3序列中保守，可能这个小蛋白在该病毒复制和基因调控中具有重要作用。根据BBTV Haikou 2分离物DNA-U3序列，PCR扩增出ORF序列并插入pET32a载体，利用原核系统表达出21kDa的融合蛋白，纯化蛋白并免疫家兔制备出特异抗血清，但目前尚未检测出受BBTV感染的香蕉中存在预测的蛋白。为了研究BBTV DNA-U3编码基因的调控元件和互作蛋白，分别构建了编码基因及其调控序列的酵母诱饵表达载体，并成功构建了感染BBTV的香蕉叶片组织cDNA文库，已通过酵母双杂交筛选获得了互作蛋白。