自体BMSCs衍生细胞外基质活性微粒凝胶再生软骨的作用及机制研究

Restoring the structure and function of articular cartilage following an injury is a crucial problem in orthopedic therapy. How to regenerate the impaired cartilage with the properties of hyaline cartilage is one of the difficult and attractive issues in this field. In our previous studies, autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were first used for fabricating extracellular matrix (ECM) scaffolds which can effectively promote cell adhesion, proliferation, and chondrogenesis. Moreover, ECM scaffolds significantly upregulated the expression of transcription factor Sox9 in the regenerated cartilage. Therefore, we speculate that the active constituents of ECM scaffolds may stimulate the Sox9-mediated cartilage regeneration, however the mechanism remains unclear. Moreover, these pre-molding ECM scaffolds can not repair the irregular cartilage defect we face in the clinic. The present study attempts to develop an injectable autologous BMSCs-derived ECM active hydrogel, which can repair cartilage defect with arbitrary shapes, so as to explore a new scheme which can effectively regenerate the structure and function of cartilage. Further, this research attempts to reveal the mechanism of chondrogenesis motivated by the ECM active constituents using siRNA, high-throughput RNA sequencing and RT-qPCR. Finally, we can provide new ideas and theoretical basis for repairing cartilage defect.

关节软骨结构和功能的再生是缺损治疗过程中面临的一个重要问题。如何使再生软骨更接近正常透明软骨成为该领域的研究热点和难点。在前期研究中，本课题组首次研制出自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）衍生的细胞外基质（ECM）支架，并证实其能有效促进细胞粘附、增殖和透明样软骨再生，且ECM支架显著上调了再生软骨中Sox9的表达。据此，我们推测ECM支架内的活性微粒成分诱导了Sox9介导的软骨再生过程，但具体机制尚未阐明。此外，上述预先塑型的ECM支架难以修复临床上不规则形状的软骨缺损。本课题拟研制一种可注射的自体BMSCs衍生ECM活性微粒凝胶，使其便于修复任意形状的软骨缺损，进而探索出一种能利用ECM活性成分高效诱导软骨结构和功能再生的新方案。本课题拟采用siRNA、高通量RNA-seq和RT-qPCR等技术，探讨并揭示ECM活性成分诱导软骨再生的分子机制，从而为软骨缺损的修复提供新思路和理论基础。

关节软骨损伤后如何重构其结构和功能是缺损治疗过程中的一个重要问题。首先，我们利用冷冻干燥、液氮研磨和酶解消化技术研制不同比例的 BMSCs 衍生ECM活性微粒凝胶，筛选出 ECM与琼脂糖的最佳混合比例。结果发现在 1:1 的比例条件下制备的ECM活性微粒凝胶能更好地维持球形软骨细胞的表型，进而促进其粘附和增殖。接着，我们探索载有种子细胞的ECM活性微粒凝胶在体外促进软骨再生的最佳浓度。结果发现随着 ECM 浓度的增加，ECM活性微粒凝胶的溶胀率和体外降解率未见明显差异，但大体结构稳定性逐渐增加。在体外诱导培养过程中，含有更多 ECM 活性微粒的 10mg/ml 复合水凝胶能再生更多的软骨样结节，获得更高的力学强度，促进更多软骨基质的分泌和软骨特异性基因的表达。最后，我们探索 ECM 浓度为 10mg/ml 的可注射的自体ECM活性微粒凝胶在软骨缺损动物模型体内的软骨重塑效果。结果发现在体内修复 24周后，ECM活性微粒凝胶组的软骨缺损区域完全被表面光滑的白色透明样软骨组织填充，且与周边组织的连续性较佳，其能有效地重塑受损软骨的结构和功能，为这种简单而有效的软骨再生新方案的临床应用提供必要的实验基础和理论依据。