水稻基腐病细菌的ExpS/ExpA双组分信号转导系统及其对致病性的调控

Dickeya zeae（Erwinia chrysanthemi pv.zeae）是世界性重要病原细菌，严重为害水稻和玉米，引起细菌性基腐病，此外,该细菌还侵染马铃薯和香蕉等多种寄主植物。目前对Dickeya zeae致病机理研究极少。本项目在发现Dickeya zeae中ExpS/ExpA双组分信号转导系统、并初步明确ExpA在病菌致病性中重要作用的基础上，拟进一步鉴定和分析另一组分ExpS；通过基因敲除、基因融合、基因表达和功能互补等分子生物学手段，鉴定和分析ExpS/ExpA双组分所调控的致病因子及相关基因，明确ExpS/ExpA在Dickeya zeae致病性中的作用及机理。本项目的实施及完成不仅可促进对调控ExpS/ExpA双组分系统的信号分子的鉴定和研究工作，为制定病害的防治策略提供依据，还可为其它病原细菌的研究提供有价值的信息及研究平台。

本项目以D.zeae菌株EC1为研究材料，通过生物信息学分析和无痕敲除的方法，构建双组分调控系统ExpS和ExpA突变体以及传感蛋白ExpS中的5个结构域突变体，分别为△Hamp、△HiskA、△HATPase、△REC和△HPT，通过基因互补试验，获得了各缺失突变菌株的的互补体R-△Hamp、R-△HisKA、R-△HATPase、R-△REC和R-△HPT。进一步通过氨基酸定点突变的方法，构建并获得了ExpS信号传导途径中磷酸化位点的3个关键氨基酸残基的点突变体H299AA、D722AA和H826AA。生物学及表型测定的结果表明，ExpS和ExpA突变体、5个结构域突变体和3个关键氨基酸残基的点突变体它们产生毒素的能力均明显下降，纤维素酶和果胶酸盐裂解酶活性减弱，并失去了抑制水稻种子萌发的能力，同时接种水稻后，其致病力下降；而其互补体则恢复生物功能。.为了进一步研究ExpA所调控的下游基因，采用illumina技术测序平台对水稻基腐病菌野生菌EC1和ExpA突变体（Ep87）两个菌株全转录组进行转录组测序。测序分析结果表明，EP87与EC1相比，上调的基因个数为1136，占所测序基因总数的26.1%，下调的基因个数为614，占所测序基因总数的14.1%，差异基因总数为1750，占40.2%，表明，ExpA调控多种生物功能，是一个综合调控因子。.为进一步验证双组分系统ExpS/ExpA所调控的致病相关基因，我们选择了16个与致病有关的基因，对ExpS和ExpA基因突变体（△expS和EP87）进行了转录表达分析，通过RT-PCR方法，结果表明，ExpS/ExpA直接或间接正向调控rsmA基因、毒素合成基因ZmsA、果胶酸盐裂解酶基因PelA-E、纤维素酶基因CelZ和CelY、蛋白酶基因PrtB和PrtG、多聚半乳糖醛酸酶基因PglR的表达；而对kdgR、ExpI、hrpN等基因的表达没有影响；ExpA正向调控rsmB基因表达，而与ExpS无关。.上述结果表明，ExpS/ExpA是水稻基腐病细菌重要的双组分系统，综合调控病菌的致病性。.此外，我们还进行了水稻基腐病菌致病突变体筛选，建立了致病基因突变体库，为进一步研究该病原细菌的致病因子及其调控机理奠定了基础。