水稻剑叶内卷基因OsFLR分子调控机制研究

The rolled leaf trait in rice has been utilized directly or indirectly in rice ideotype plant architecture and high-yield breeding. However, the molecular regulation mechanism of rice leaf development and morphosis is still not clear. We analyzed the genome expression profiles in various organs at seedling, booting and heading stages in rice Pei’ai 64S. OsFLR, encoding a nucleus-localized protein of unknown function, has self-activating and was identified as a novel flag leaf development regulator gene. Overexpression of OsFLR in rice led to adaxially rolling at the base of the flag leaf, and positive effects on leaf angles, flag leaf area, the number of guard cells and chlorophyll content. Compared to the wild type, the number and shape of parenchyma cells in the middle vein, bulliform cells and parenchyma cells in small veins of leaf blades are also changed in transgenic lines. The following experimental studies will be performed in this work: functional analysis of OsFLR by overexpressing and CRISPR/Cas9 gene knockout in transgenic rice lines, yeast two-hybrid and biomolecular fluorescence complementation analysis, spatial and temporal gene expression pattern assessment and transcriptome sequencing analysis of expression of genes regulated by OsFLR. The main research objectives are to analyze the functions of the OsFLR related to flag leaf development, explore its mechanism of action, and provide a theoretical reference to develop new high quality and yield rice varieties.

改良剑叶性状可显著提高水稻产量，水稻卷叶资源早已运用于实际品种改良，卷叶作用也在高产和超高产育种中得到充分体现，但卷叶相关基因及其分子调控机制的研究则刚起步。通过水稻基因芯片分析，筛选到一个与剑叶形态发育相关的功能未知基因OsFLR，该基因定位在细胞核，具有转录激活活性。初步研究表明，过量表达OsFLR使水稻剑叶基部向近轴面卷曲扭转，剑叶面积、叶夹角，叶绿素含量增加，每穗粒数增加27.46%。推测泡状细胞，中脉气腔、叶枕及叶侧脉维管束鞘近轴面薄壁细胞的数目、形状的变化是剑叶内卷的原因。因数据库中无合适突变体，本项目拟在现有基础上，完成CRISPR/Cas9无义突变株表型及功能分析、酵母双杂交与双分子荧光互补分析、转录组测序分析以及基因时空表达模式分析。初步阐明OsFLR表达模式、该基因及其下游基因在维持剑叶正常形态和功能上的作用，为“理想株型”超级稻分子选育提供新的卷叶候选基因和理论参考。

卷叶不仅是水稻叶片形态特征之一，是水稻“理想株型”育种中的重要组成部份，更是一种植物应对自然界逆境刺激，脱水避旱的机制。本项目主要研究成果包括：（1）从水稻基因芯片分析中筛选到一个功能未知的多效调控基因OsFLR/OsSGL，定位在细胞核，具有转录激活活性。过量表达该基因使水稻剑叶基部向近轴面卷曲扭转，剑叶面积、叶夹角，叶绿素含量增加；同时也能引起多个产量性状显著增加：水稻穗长增加22.2%，每穗粒数增加27.4%，水稻粒长增加24.8%，千粒重增加16.3%，最终理论产量增加46.2%，同时提升水稻的耐旱能力。（2）OsSGL基因表达具有时空特异性，在生殖生长期的花器官、胚乳中表达水平较高，推测OsSGL基因有可能在水稻生殖生长期发挥作用。（3）利用CRISPR/Cas9技术成功获得OsSGL基因敲除突变体（ossgl）。（4）通过对比观察、分析过量表达植株、ossgl、野生型植株在表型、生理生化、细胞结构等方面的差异，推测剑叶泡状细胞以及侧脉维管束鞘近轴面薄壁细胞数目、大小、形状及排列方式的改变是引起剑叶向近轴面卷曲的主要原因。（5）结合RNA-Seq数据和qRealtime-PCR方法，对已筛选出的一批候选差异表达基因以及已报道的已克隆的水稻叶片形态建成相关基因的表达模式进行研究分析，筛选可能的下游调控基因。（6）对OsXCL基因进行了组织特异性（胚乳和叶片）过量表达分析，首次发现在水稻中特异性表达该基因所引起的表型变化与组成型表达的不同。综上所述，我们推测OsSGL基因可能是一个上游调控基因，其表达量或者表达模式的变化可特异性引起一系列相关基因或遗传因子的反馈式级联反应，改变细胞分裂、形态发育相关基因以及逆境响应基因的表达模式，影响顶端分生组织细胞的有丝分裂、分化发育、类型及排列，最终引起水稻根、剑叶、穗等多组织器官的形态构成以及逆境耐受能力的变化。提高水稻产量和品质一直都是水稻育种的重要目标，叶片尤其是剑叶的形态改良可显著提高水稻产量，深入研究OsSGL基因的功能与作用机制，将对培育高产、优质水稻新品种具有重要的理论与实际意义。