基于简单重复序列的紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的定位研究

Cytoplasmic male sterile line is an important material for crop heterosis utilization, matching the "Three-Line" and hybrid breeding. Because limited research information is available on their mode of inheritance, the molecular basis of sterility and its restoration, this project intends to locate the restorer gene for cytoplasmic male sterility in alfalfa based on simple sequence repeats(SSR).Using the fertility performance of F1 and F2 segregate dgeneration of cytoplasmic sterile lines and the restorer lines as materials to identify it’s inheritance pattern; Using SSR markers to locate its nuclear sterile restorer genes in chromosomal; Build up the fertile gene pool and sterile gene pool, Bulked Segregation Analysis Method (BSA)has been applied to identify SSR markers linked to the nuclear sterile restorer gene, and preliminarily locate alfalfa restorer genes, and as a result, to further discuss the value of marker-assisted selection breeding, provide the ground for fine mapping and cloning of alfalfa CMS restorer genes and accelerate the selection of excellent restorer.

细胞质雄性不育系是植物杂种优势利用、“三系”配套和新品种选育的重要材料。为针对目前紫花苜蓿细胞质不育的遗传模式不明确、细胞质不育与育性恢复机制研究基础薄弱等问题，本项目拟开展基于简单重复序列的紫花苜蓿细胞质雄性不育恢复基因的定位研究。以紫花苜蓿细胞质雄性不育系和优良恢复系为材料，利用其杂交F1代和F2代的育性表现，明确苜蓿细胞质不育的遗传模式；利用SSR标记确定其核内不育基因的染色体定位；利用集群分析法构建不育和可育基因池，对不育恢复基因进行SSR分析并对苜蓿细胞质不育恢复基因进行初步定位，为未来探讨细胞质不育恢复基因的精细作图和克隆恢复基因、分子标记辅助选择育种的价值及优良恢复系的快速选择提供理论依据。

本研究通过已获得的紫花苜蓿细胞质雄性不育系材料MS-GN-1A和优秀恢复系材料MS178为亲本，经杂交、强迫自交等培育，构建了 F2和F1两个群体。通过调查和分析 F2群体与F1群体每一株植株的育性，确定紫花苜蓿CMS育性恢复基因的遗传模式；利用简单重复序列（SSR）并结合群体分离分析法（BSA），对两个群体植株材料进行试验分析，进而筛选出与恢复基因Rf连锁的分子标记，并对Rf进行遗传定位。取得的实验结果如下：.（1）本研究使用紫花苜蓿不育系MS-GN-1A为母本，恢复系MS178为父本做组合构建BSA分离群体，所获得的F1代均表现为雄性可育，花粉可育率为100%，F2代分离群体在开花期镜检发现全部变为不育和可育类型；F2分离群体共有 221 个单株，经镜检其中不育株数57，可育为 164 株，未发现半不育株，可育和不育的分离比例符合 3:1 的比例。属于典型的单基因控制的孢子体不育。.（2）以育性镜检结果作为依据，将分离群体分成两组，可育和不育组。分别提取可育和不育两组的基因组DNA，各组随机抽取20个样品DNA等量混合，用来构建可育和不育基因池，以此进行对恢复基因的定位。试验使用40对SSR引物扩增基因池DNA，获得3个具有多态性的分子标记，分别是Mt2c12、AW166，初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上所有引物进行合成，进一步进行引物筛选，最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153遗传距离分别为19.0cM，20.9 cM，44.6 cM，72.1cM。.（3） 经研究发现紫花苜蓿细胞质雄性不育的败育发生是在四分体时期绒毡层细胞和花粉的异常发育的同一时期。紫花苜蓿不育系的小孢子数量以及形状上与保持系相差甚多；与保持系相比，紫花苜蓿不育系的胼胝质没有解体不能释放小孢子；初步推测紫花苜蓿不育系的花粉败育应与药隔维管束的异常发育有关。.（4）为研究紫花苜蓿细胞质雄性不育系的生理生化机制，以不育系及其同型保持系为原料，针对不同发育时期花蕾中可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛含量及抗氧化酶（过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶）活性进行了测定。结果表明，随着花蕾的生长发育和花粉的发育成熟，不育系MS-GN1A花蕾发育各个时期的可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量均出现亏缺