PAK1/PP2A通路在衰老致房颤过程中的作用机制研究

房颤的患病率随年龄增长而升高，而老年人心房肌细胞衰老可能在房颤的发生发展过程中起重要作用，但其机制目前研究较少。本课题组通过对山羊房颤动物模型和SD乳大鼠心肌细胞衰老模型的研究发现，衰老心肌和房颤心肌具有类似的电学重构和结构重构特征。PAK1/ PP2A通路参与了心肌细胞多个离子通道和细胞骨架的调控，房颤患者心房肌细胞PP2A表达下降。我们的预试验发现大鼠心肌细胞PP2A随年龄增长表达下调，据此推测PAK1/ PP2A通路改变是衰老致房颤重要机制之一。本研究拟通过诱导房颤的细胞模型和动物模型，检测PAK1/PP2A通路在衰老致房颤过程中的作用及其机制。并进一步构建PAK1的持续活性表达载体与沉默载体，转染HL-1细胞，诱导房颤模型，验证该通路在此过程中的作用及其机制，以期在房颤的病因和发病机制研究方面提供新的思路和方向，为老年房颤患者的治疗提供新的干预靶点。

先前的研究表明：在房颤患者，房颤的犬和细胞模型中均可以观察到加速的心房肌细胞凋亡现象。而提前给予热休克蛋白70（HSP70）的激动剂（GGA）可以减少凋亡的发生，从而降低临床中心脏手术后新发房颤的发生和动物实验中房颤的诱发。进而，我们推测，细胞凋亡在房颤发生发展的过程中起着重要作用。心房肌细胞的凋亡可以被多种病理因素诱发，如：细胞因子和炎症介质的释放，氧化应激，以及高频的电刺激。高频电刺激，在体内和体外实验中均可以导致细胞凋亡的加剧，产生心肌损害。利用其建立的房颤模型，近年来被广泛运用于对房颤病理生理机制的研究。在我们的实验中，我们对HL-1细胞（来源于小鼠的心房肿瘤细胞）进行高频电刺激，拟探讨高频电刺激诱导的细胞凋亡中，可能参与调节的凋亡通路，以进一步完善房颤的发生发展机制。我们利用CCK-8检测细胞活力发现，高频电刺激可以显著降低细胞活力，且这种作用具有时间和电压依赖性。刺激诱导的细胞凋亡，我们利用Hochest染色和流式细胞仪进行检测。Western Blot的结果显示：高频电刺激诱导的细胞凋亡伴随着磷酸化的JNK, P38 MAPK, ERK1/2的表达增多。同时，线粒体膜电位的降低，细胞色素c由线粒体向细胞质的释放，Caspase-9，Caspase-3的活化提示我们：依赖线粒体途径的凋亡通路参与调节了电刺激诱导的细胞凋亡。而在电刺激前分别给予JNK, P38 MAPK, ERK1/2抑制剂可以抑制MARKs磷酸化形式的表达，逆转电刺激导致的凋亡，BAX的上调以及BCL-2的下调。提前给予HSP70的激动剂，同样可以逆转电刺激导致的凋亡，BAX的上调以及BCL-2的下调，但是它对MAPKs通路的表达没有明显影响。结论：MAPKs/HSP70调控的线粒体途径的凋亡通路参与调节了高频电刺激诱导的细胞凋亡。