利用异种GVHR裸鼠模型探讨重组HLA-G二聚体诱导免疫耐受

T细胞在移植排斥反应的发生、发展以及免疫耐受的诱导中均起到至关重要的作用。大量体外实验显示HLA-G具有明显的免疫抑制功能，且体内表达HLA-G的移植受者对移植物呈现良好的耐受状态，但迄今尚无直接证据证明HLA-G在体内确实能缓解移植排斥反应，导致该分子的实际应用缺乏实验基础。HLA-G发挥生物学功能依赖于两个HLA-G分子通过二硫键构成的二聚体。然而，细胞自然产生的HLA-G主要以单体形式存在。本项目采用基因工程技术，将编码可溶性HLA-G的重链与人IgG Fc段的基因融合，制备重组的HLA-G二聚体。通过体外混合淋巴细胞培养模型和体内人淋巴细胞输注裸鼠建立异种移植物抗宿主反应（X-GVHR）动物模型，在体内、体外探讨重组HLA-G二聚体诱导人T细胞耐受的作用与机制，为该分子应用于抗移植排斥反应提供理论依据和实验依据。

本课题首先通过对几种培养基的HLA-G二聚体表达量的比较，选择确定了无血清培养基作为稳定表达HLA-G二聚体的细胞株表达培养基。并采用了PEG浓缩法、离子交换层析法、超滤、蛋白A柱等四种浓缩与纯化方法，对HLA-G二聚体进行了的浓缩与纯化，通过PAGE、ELISA、微珠流式构象检测以及同种T细胞增殖反应模型等方法鉴定，确定了PEG浓缩方法可获得较高纯度、较高含量的HLA-G二聚体并保持其抑制效应。.本课题利用同种T细胞反应模型，在体外研究HLA-G二聚体对T细胞耐受的影响，研究结果表明，HLA-G二聚体可抑制同种CD8+T细胞活化，诱导同种反应体系中CD4+的Treg的增加；抑制同种CD8+细胞分泌IFN-γ，促进同种CD8+细胞分泌IL-4，但对同种CD8+细胞分泌TGF-beta 无影响。本课题还体外研究了HLA-G二聚体对DC细胞的成熟与巨噬细胞极化的影响，研究结果表明HLA-G二聚体可抑制DC细胞的成熟，抑制M1的极化，而对M2极化则无影响。.本课题根据模型鼠的生存期、人CD3+细胞在尾静脉血、组织、器官中的浸润情况等指标研究，确定并以NOD-SCID小鼠为模型鼠，建立稳定可靠的X-GVHR的模型。并在体内观察了HLA-G二聚体对X-GVHR的影响，研究结果表明，HLA-G二聚体在本研究优化的纯化方法与有效剂量的方案下，未能观察到改善模型鼠的X-GVHR症状和延长其生存时间，即未表现出HLA-G二聚体具有抑制X-GVHR的作用。.鉴于HLA-G二聚体不能改善模型鼠的X-GVHR症状与延长其生存时间，本课题取消原计划中探讨可溶性HLA-G二聚体诱导T细胞耐受的体内作用机制研究计划，研究了银屑病患者HLA-G14bp、*0105N基因型分布对外周血单个核细胞sHLA-G最大释放量的影响，研究结果表明HLA-G14bp、*0105N基因型分布影响外周血单个核细胞sHLA-G最大释放量，并与银屑病关联。.本课题按年度计划基本完成了课题设计中各项任务，培养了博士生6名，硕士生5名，已资助发表文章3篇，并在随后两年内将发表SCI论文2篇，中文核心4篇（正在统计数据、成文中），申报专利一项（专利申报号为200910273098.7），但因本研究组博士生所发表论文有所披露，未能获批专利。