CMV感染IFN-γ高表达和FoxP3基因敲除小鼠诱发胆道损伤及闭锁机制研究

Biliary atresia(BA) is a highly fatal disease in neonates, and the etiology is largely undefined. Our preliminary study found a high cytomegalovirus (CMV)infection index at the time of diagnosis, suggesting an important role in the pathogenesis of BA.Whether CMV infection is the etiolgy of BA has not been verified in animal model. Recent research found that children with BA showed a significantly increased interferon-γ(IFN-γ) level and reduced Regulatory T cells(Tregs) level, both of which played a key role in BA. We hypothesize that CMV infection tends to cause duct epithelium injury and trigger BA in IFN-γ overexpressed or Tregs reduced body. To test this hypothesis, we will establish a CMV infecting mouse model with IFN-γ intervention and a FoxP3 knock-out mice model with CMV infection. Through Flow cytometry,immunofluorescence and MACs, we will figure out whether CMV infection induce BA in special animal models, and explore the mechanism of CMV-induced biliary damage and atresia. This study will establish CMV infecting special animal models, which is a very innovative idea,trying to provide a more reasonable animal model for clinical prevention and treatment of BA.

胆道闭锁（Biliary atresia, BA）是新生儿中高死亡率的疾病，病因尚不明确。本课题组前期研究发现，巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）感染与BA发生具有强相关性。但CMV感染是否为BA的病因，目前尚未在动物模型中得到验证。近期研究发现BA患儿干扰素-γ表达显著增高而调节性T细胞减少，且两者在BA发生中起重要作用。本研究推测BA可能非单因素所致，CMV感染特定的免疫失调人群后，更易诱发胆道损伤及闭锁。为验证该假说，本研究将建立CMV感染FoxP3基因敲除小鼠和干扰素-γ高表达小鼠模型，采用流式细胞检测、免疫荧光及磁珠分选等方法，研究CMV感染免疫失调小鼠后是否会诱发BA，探讨CMV感染在胆道损伤及闭锁发生中的重要作用，并明确CMV感染诱发胆道损伤及闭锁的具体分子机制。本研究将从CMV感染免疫失调模型这个新思路，为揭示胆道损伤及闭锁的发病机制及临床防治奠定基础。

背景：研究发现巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）感染可能与胆道闭锁（Biliary atresia, BA）的发生具有很强的相关性，且调节性T细胞（Regulatroy T cell, Treg）缺乏可能是导致BA进行性发展的原因。我们提出假说，Treg缺乏的新生个体，围生期感染少量的巨细胞病毒后会诱发胆管特异性的免疫炎症反应继而导致进行性的胆管损伤，可能是导致BA发生及发展的重要原因。.方法：为验证该假说，我们建立了Treg缺乏的新生幼鼠模型，并予以低浓度的巨细胞病毒感染，让我们的模型尽可能地重现BA患儿的经历。通过流式细胞检测方法测定Treg、CD3及CD8淋巴细胞的比例，RT-PCR、小鼠炎症因子蛋白芯片及免疫染色等方法检测炎症及凋亡相关因子的表达，并通过免疫荧光染色和western blot方法检测血清及肝脏中的自身抗体。.结果：低浓度巨细胞病毒感染Treg缺乏幼鼠后，诱发了严重的肝内外胆管特异性的炎症反应，而肝细胞及肝内血管未受损，肝内胆管所呈现的损伤及闭锁情况与人类BA患儿的肝内胆管损伤情况非常类似，且肝外胆管出现了局部炎症性阻塞，同时伴有血清总胆红素和直接胆红素的升高。同时我们还发现，该动物模型肝脏中的CD3和CD8淋巴细胞显著增加。进一步研究发现，该动物模型血清中存在胆管上皮细胞特异性的自身抗体，经验证发现其中一种是针对胆管上皮蛋白α-烯醇化酶的自身抗体，证实该动物模型诱发了胆管特异性的细胞免疫及体液免疫反应。进一步探索潜在的分子机制，我们发现肝脏组织中Th1型相关基因和细胞因子如TNF-α、STAT-1、淋巴细胞趋化因子、IL-12p40及MIP-1γ的表达量显著增高。Th1相关基因和细胞因子的表达量升高，提示Th1反应参与了该模型中炎症及自身免疫反应介导的胆管损伤。 .结论: 低浓度巨细胞病毒感染Treg缺乏幼鼠后，诱发机体产生了一系列自身免疫反应及炎症反应，并对肝内外胆管造成严重的损伤。考虑到在我们大多数的胆道闭锁患儿中，同时存在既往巨细胞病毒感染及Treg缺乏，我们提出，两者的共同作用很有可能在BA的发生与发展中起到重要作用，需要引起重视。