基于piggyBac转座子的弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫构建及特性研究

弓形虫是一种重要的人兽共患寄生虫，SAG1是构象依赖性蛋白，也是弓形虫病诊断和疫苗研究的重要抗原。蜥蜴利什曼原虫对哺乳动物无致病性。piggyBac转座子是一种高效转基因工具。为获得弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫，阐明其生物学和免疫学特性，本研究拟以蜥蜴利什曼原虫作为弓形虫真核表达载体和疫苗载体，克隆利什曼原虫DHFR-TS调控序列，构建新霉素抗性基因表达盒、弓形虫SAG１基因表达盒及表达piggyBac转座酶的辅助质粒，建立利什曼原虫piggyBac转座系统；电穿孔转染蜥蜴利什曼原虫，通过G418筛选及相关鉴定，获得表达弓形虫SAG1基因的转基因蜥蜴利什曼原虫；通过鉴定和分析弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的生物学特性（生长特性、对小鼠、犬、猫等动物的病原性）和免疫学特性（在小鼠、犬、猫等动物的抗原性及免疫保护效率），为弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的疫苗应用奠定基础。

弓形虫病是由弓形虫引起的一种重要人兽共患寄生虫病。蜥蜴利什曼原虫的自然宿主是蜥蜴，对哺乳动物不致病，可作为真核表达载体和疫苗载体。本研究利用PCR扩增技术扩增弓形虫表面抗原基因SAG1，将其克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2，构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1。利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫，经G418筛选阳性克隆，经SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定，证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。将重组体免疫小鼠，能诱导特异的细胞免疫和体液免疫，攻虫试验表明，小鼠的存活时间明显延长，产生一定的免疫保护作用。.利用PCR扩增技术从弓形虫RH株基因组中扩增出弓形虫主要表面抗原基因SAG1，将其克隆进真核表达载体pLEXSY-neo2，抗原基因SAG1经序列测定分析，长片段为957bp，与Genbank上发表的国际标准株GUY-1992-RUB株SAG1基因同源性为98%。经酶切鉴定，成功构建了真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1。.采用电穿孔转染技术将真核表达载体导入蜥蜴利什曼原虫，载体经同源重组整合进宿主基因组内，阳性克隆因整合进G418抗性基因neo而能在筛选培养基中生长，未整合的虫体及阴性对照则死亡，经药物G418筛选两周，获得阳性虫体。运用SAG1特异性引物及表达载体诊断引物进行PCR鉴定，结果阳性虫体中能扩增出特异的目的条带。虫体在新鲜筛选培养基中静置培养72h后提取表达的蛋白，SDS-PAGE图中分泌型表达与胞内表达的蛋白均出现约33KD的条带，阴性对照中无目的条带。Western blotting鉴定表达蛋白均能被抗组氨酸标签的单克隆抗体识别。重组体免疫小鼠后能显著提高机体免疫应答水平和淋巴细胞的增殖水平（P<0.05），IgG、IL-2、INF-γ水平均有所上升，但INF-γ更为明显。攻虫试验表明各蛋白免疫组均能显著延长小鼠的存活时间。研究结果为重组弓形虫SAG1-蜥蜴利什曼原虫的疫苗应用奠定基础。