茶多酚EGCG通过调控PCSK9降低LDL-C的实验研究

Statin is a very common lipid-lowering-drug, but it increases the level of circulating PCSK9，and potentially limits the pharmacological effects of reducing LDL-C concentration. With the development of PCSK9 inhibitors, the researchers find thatin inhibitors further reduce LDL-C above maximally tolerated statin therapy. In addition，tea drinking may be play an important role in lipid metabolism. However，it is not clear whether the tea regulates the concentration of LDL-C via PCSK9 pathway. Our data of preliminary experiment showed that EGCG decreased PCSK9 expression but increased LDLR expression with or without statin treatment in HepG2 cells. Therefore, our hypothesis is EGCG inhibits the expression of PCSK9 in liver, and further promotes the uptake of LDL and lowers the plasma LDL-C level. To verify this hypothesis, we will analyze expressions and activities of PCSK9 and LDLR with or without statin therapy in HepG2 cells and in vivo.Moreover, we further reveal the molecular mechanism underlying EGCG regulates PCSK9 via PI3K/AKT and /or AMPK signaling pathways and transcriptional factors (SERBP2 and/or HNF1α) activities. Next，we will set up the animal model of high-fat-fed，and observe the PCSK9 expression in liver and the level of circulating LDL-C in vivo. Our results will provide a new experiment basis of PCSK9 inhibitor, and provide a new supplemental case for the improvement of statin therapy.

PCSK9可通过促进LDLR的降解而升高LDL-C。而他汀类降脂药之所以不能达到最佳降脂效果，就是因为其引起PCSK9的升高。因此，从日常饮食中寻找到一种能够抑制PCSK9的物质是非常有必要的。饮茶被认为能够降低血脂，但其机制不详。我们前期结果显示，茶多酚EGCG可以降低HepG2细胞内源性以及他汀诱导的PCSK9水平，而升高LDLR的表达和活性。因此，推测EGCG可能通过抑制肝的PCSK9水平来促进LDLR活性，降低循环中LDL-C，从而达到降脂作用。为验证该假设，拟从细胞水平和动物水平，分析EGCG对内源性和他汀治疗后肝的PCSK9和LDLR的影响，观察PI3K-AKT和AMPK通路激活以及转录因子的结合活性。再从动物水平观察血中PCSK9和LDL-C变化，从而阐明EGCG调控PCSK9-LDLR-LDL-C的分子机制，为“饮茶降脂”观点提供实验依据，为提高他汀疗效，提供辅助膳食添加。

动脉粥样硬化性心脏病（ASCVD）是心血管疾病死亡的重要因素，它的预防与治疗一直是一个备受关注的热点问题。近20年来的临床研究显示，降低LDL-C水平是治疗动脉粥样硬化（AS）的基础。近些年，随着前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）抑制剂的研发， PCSK9已成为新的血脂干预的靶点。但是， PCSK9抑制剂进入临床使用后，仍存在安全性问题。因此，寻找一种新的天然PCSK9抑制剂，则显得格外重要。中国饮茶历史悠久，素有“饮茶降脂”之说， 但是，其作用机制尚不明确。本研究分别从人群、动物和细胞水平，证实了绿茶的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）可能作为天然的PCSK9抑制剂，降低血中LDL-C水平，达到降脂作用。在临床研究中，通过对饮茶者和不饮茶者的血浆PCSK9和LDL-C的水平进行了比较，发现饮茶者明显比不饮茶者的PCSK9和LDL-C水平。以高脂喂养建立血脂异常大鼠模型，发现EGCG灌胃后，可以抑制血脂异常大鼠的肝脏组织中PCSK9的表达，上调其LDLR的表达，进而降低血中PCSK9和LDL-C水平。为了进一步探讨EGCG调节血脂的分子机制，培养人HepG2细胞，发现EGCG作用24h，可明显降低HepG2细胞PCSK9表达，而升高LDLR的表达和LDL的摄取量，这与临床和动物实验的结果一致。为了检测AMPK和PI3K-AKT 通路是否参与EGCG调节PCSK9表达，分别使用AMPK（Dorsomorphin）和PI3K（LY294002）抑制剂，结果显示，LY294002可以阻断EGCG引起的LDLR的表达，对PCSK9并不受影响；而AMPK对PCSK9和LDLR的表达都没有影响。进一步发现，EGCG可以促进AKT的磷酸化活性。另外，使用最新技术ATAC-seq，检测染色质开放区域的程度，得到3个转录因子HNF1α、FOXO3a 和SREBP2。RNAi技术从反向验证这3个转录因子，发现核内HNF1α和FOXO3a参与EGCG调控PCSK9，进而影响LDLR的表达和LDL 摄取量，而EGCG可通过PI3K-AKT通路调控核内SREPB2直接调控LDLR和LDL摄取量。除此以外，通过自噬活性的检测和LC3I/I