白菜持绿性突变基因brsg精细定位及鉴定

Stay green is the phenomenon of remaining green but not to be yellow at the end of the growth period because of abnormal step happened in plant chlorophyll degradation during the senescence process. It is of special significance to Pakchoi which is used green leaf as commodity. One stay green mutant was obtained in previous research and it is proved that its trait is controlled by a single recessive gene, named brsg, the gene was located on chromosome A03 in the range between 2Mb by BSA-seq. The project intends to use F2 segregation population to fine mapping brsg gene and predict the biological function of the gene by the reference of Chinese cabbage genome information. The stay green mutant gene brsg will be confirmed with the results of analyzing the middle products content, related enzyme activity during chlorophyll degradation in the mutant and spatial and temporal expression pattern analysis of the candidate gene. This result will be helpful for the better use of the materials to modified Pakchoi varieties, and enrich the knowledge on plant senescence and chlorophyll degradation regulation.

持绿性是指植物在生育末期叶片依然保持绿色不变黄的现象，其对以绿叶为产品器官的白菜具有特殊重要意义。申请者前期筛选到1份持绿性白菜突变体，证明了其持绿性由单隐性核基因控制,并将该基因定名为brsg，已采用BSA-seq方法将该基因初步定位在A03染色体2Mb范围内。本项目拟利用大规模F2分离群体，精细定位brsg基因，参考大白菜基因组信息，预测定位区间内基因的生物学功能，并结合突变体叶绿素降解中间产物含量及相关酶活性测定结果与候选基因的时空表达特性，筛选确定并克隆候选基因，为下一步转基因功能验证奠定基础。研究结果有助于更好地利用该材料改良白菜品种，同时也可以丰富植物衰老和叶绿素降解代谢基因调控方面的知识。

白菜是我国南北各地广泛栽培的蔬菜作物，在蔬菜周年供应中占据重要地位。在白菜的栽培后期，以及在贮运保鲜及货架期间，其外叶容易衰老变黄，造成产量损失和产品质量下降；植株衰老后叶片仍然保持绿色而不变黄的特性称为持绿性。由此可见，持绿性蔬菜品种对于以叶片为产品器官的白菜具有特殊重要意义。申请人前期在白菜育种材料中首次发现并获得1份持绿突变体nye，其全生育期植株保持绿色不变黄。其持绿表型稳定可遗传, 遗传分析证明了nye的持绿性呈单基因隐性遗传，遂命名为Brnye1（原名brsg）。利用BSA-Seq方法，已将Brnye1定位于A03染色体的2.0Mb区域。利用F2群体，结合SSR分析精细定位突变基因，将持绿突变基因Brnye1精细定位于A03染色体的81.01kb区间。参考白菜基因组注释信息，并结合DNA序列变异分析，预测与拟南芥AtNYE1基因同源的Bra019346基因为目标基因Brnye1，突变体该基因的第2个外显子上有一段40bp的片段插入，导致移码突变，形成TAA终止密码。在持绿突变体nye中叶绿素（Chl）降解代谢产物Mg-dechelatase活性在幼嫩期或衰老年期下降表明，Chl降解的损伤步骤可能发生在Chl降解的开始，不存在危险的光毒性分子，Brnye1基因在叶片中极显著表达，在幼芽，根，花，蕾中也有较强表达；在茎和角果中表达较弱。通过查阅文献获悉复旦大学蒯本科团队报道候选基因Bra019346的同源基因缺陷导致拟南芥持绿表型。因此我们利用该拟南芥持绿突变体，将白菜野生型Bra019346基因过表达至该持绿突变体，筛选恢复表型的转基因植株，并对其的基因表达及叶绿素含量进行了测定，成功探明了候选基因功能。结合qRT-PCR技术摸清了突变基因在叶片中特异表达的表达特性。同时，探索持绿性突变引起的突变体在生理特性上的变异，从生理和分子水平上阐明了白菜持绿性突变基因Brnye1的功能。研究结果可以揭示持绿突变基因的功能与作用，为更好的开发利用这一珍贵的遗传资源奠定基础。