非小细胞肺癌循环肿瘤细胞的捕获富集和双光子荧光信号放大检测新方法研究

Circulating tumor cells (CTCs) are regarded as the “liquid biopsy” of the primary tumor, the detection of CTCs in the blood of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients is crucial for early cancer diagnosis. However, their low numbers in blood make their clinical application exceedingly difficult. In this project, the early diagnosis of NSCLC is aimed as a breakthrough, combined with an aptamer recognition element and signal amplification strategies, novel biosensor platforms based on the core-shell structured Fe3O4@Au composite nanoparticles and two-photon fluorescence probes will be constructed, allowing for high-efficiency capture and detection of CTCs in peripheral blood using new two-photon fluorescence associated with signal amplification strategies. This project focuses on the following two aspects: (1) High-efficiency capture and enrichment of CTCs based on Fe3O4@Au composite nanoparticles; (2) Detection of CTCs based on carbazole derivatives (BMVC-Bu) associated with hybridization chain reaction (HCR) signal amplification, as well as graphene quantum dots (GQDs) associated with nanoparticles-enabled signal amplification strategies. From this project, new two-photon fluorescence associated with signal amplification strategies with the advantages of high specificity and high sensitivity will be developed, which will provide an important theoretical basis and detection platform for early diagnosis and quantitative detection of NSCLC patients.

循环肿瘤细胞（CTCs）作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”，对其检测有助于非小细胞肺癌（NSCLC）的早期诊断，但因在外周血中数量稀少而限制了其临床应用。本项目拟以NSCLC的早期诊断为突破口，构建基于核-壳结构的金磁复合纳米颗粒和双光子荧光探针的生物传感平台。同时结合核酸适体的特异性识别性能和信号放大策略，提出外周血样中CTCs的高效能捕获和双光子荧光信号放大检测新方法。主要内容包括：（1）基于Fe3O4@Au复合纳米颗粒的磁富集和捕获CTCs；（2）基于咔唑类（BMVC-Bu）双光子荧光探针的杂交链式反应(HCR)信号放大检测CTCs，以及基于石墨烯量子点（GQDs）双光子荧光探针的功能纳米材料信号放大检测CTCs。本项目的实施将建立新型的特异性捕获和高灵敏性的双光子荧光信号放大技术，同时为NSCLC患者的早期诊断和检测指标的定量化提供重要的理论依据和技术支持。

针对现有的双光子发光材料存在双光子吸收截面小、发射光谱范围窄、无特异靶向性，以及“一对一”的信号转换模式所造成的灵敏度低等问题，本项目围绕双光子荧光信号放大技术策略的设计这一研究主线，结合特定反应和靶向识别元件，系统地开发了一系列高灵敏、信号放大的传感体系。圆满完成了目标物的体外检测和成像的既定研究目标，建立了符合细胞水平和组织层面上的通用型分析技术平台。首先，课题组根据项目计划执行，设计出了一种功能纳米材料信号检测放大策略，即通过SiO2纳米颗粒表面修饰多个小粒径GQDs来实现“一对多”的提高信号转换效率的目的，结合靶向识别元件aptamer，构建了一种新型的靶向双光子复合纳米探针SiO2@GQDs-Apt。其次，在项目执行中课题组也构建了一种新型的基于特定反应策略和β-CDP荧光信号放大方法的新型传感平台，将MnO2纳米管作为开关试剂，不仅能够显著淬灭纳米探针的荧光，而且能够通过MnO2被GSH还原为Mn2+，从而实现对GSH的高灵敏检测和细胞成像研究。同时，将Cyt c引入到此设计理念中，利用Cyt c能够被胰蛋白酶水解为氨基酸片段的特定反应策略，实现对胰蛋白酶活性的高灵敏检测，从而拓展了通用型传感平台的应用。再次，通过在DEASPI@β-CDP双光子纳米胶束表面原位生长CoOOH纳米片，伴随着CoOOH被AA还原为Co2+，探针的荧光强度逐渐增强，在2-50 μM浓度范围内，呈良好的线性关系，且具有较低的检测限（0.27 μM）。成功实现了在细胞裂解液中抗坏血酸（AA）的高灵敏检测，以及在细胞和深层肿瘤组织中内源性AA的3D双光子成像研究。最后，项目组还利用两亲性均聚物PMMA-co-MAA在水中能够形成“外亲水、内疏水”的纳米胶束的特性，实现对疏水性双光子荧光小分子DEAS的包裹，从而提高其水溶性和双光子性能。而修饰靶向识别元件Sgc8c于纳米胶束表面制备出靶向双光子纳米探针，成功实现了CEM细胞的靶向识别和成像研究。