深入研究整合素连接激酶在益气养精法抗肺癌转移中的重要作用

在国家自然基金项目（30701114）和上海市科委启明星项目（08QA14061）资助的前期研究证实：1、ILK(integrin-linked kinase)是调控上皮-间质细胞转化（Epithelial-mesenchymal transition EMT）核转录因子Snail的关键信号分子；2、临床验证有效复方肺岩宁具有显著降低ILK(integrin-linked kinase)基因表达的作用；本研究拟在此基础上，采用RNAi（RNA-interference）的方法，体内外实验相结合进一步研究:ILK基因沉默后GSK-3β磷酸化活性、AKT/PKB磷酸化活性变化；AP-1、MMP-9、β-catenin、 cyclin D1、VEGF基因的表达；细胞周期变化；细胞增殖、侵袭、迁移等的变化。拟揭示ILK信号在肺岩宁方抗转移发生中的重要作用。

目的：前期证实肺岩宁方具有显著降低整合素连接激酶基因表达作用的基础上，采用RNAi的方法沉默ILK基因后，转染人肺癌细胞A549，进一步观察A549细胞生物学及ILK信号通路靶基因和靶蛋白表达变化；方法：RNAi方法构建ILK RNAi慢病毒表达载体、测序和Real-time PCR鉴定；MTT、流式细胞仪、TransWell小室模型及单克隆形成检测A549细胞生物学活性；Real-time PCR及Western Blot检测ILK信号途径靶基因和靶蛋白表达；裸鼠成瘤模型的建立。结果：①成功构建了ILK RNAi慢病毒表达载体；② ILK基因沉默后可以明显促进人肺腺癌细胞A549的凋亡，降低细胞迁移和成瘤能力，对细胞周期无明显影响，10%的中药肺岩宁方含药血清有促进细胞凋亡及抑制细胞迁移和克隆形成的能力。③与NC组比较，KD组具有下调GSK-3β、VEGF mRNA和蛋白表达的作用，上调cyclinD1、MMP-9 mRNA和蛋白表达的作用，Akt表达无变化，AP-1、β-catenin在mRNA水平表达升高，蛋白水平表达则下降；与KD组相比，KD+10%中药肺岩宁含药血清和KD+10%DDP具有下调VEGF、cyclinD1、MMP-9和β-catenin 蛋白表达的作用，上调GSK-3β蛋白表达；下调AP-1、cyclinD1 mRNA表达的作用；与KD组相比，KD+20%中药肺岩宁含药血清具有下调AP-1、cyclinD1和MMP-9蛋白表达的作用④成功构建裸鼠成瘤模型，阻抑ILK基因表达裸鼠瘤组织中靶基因GSK-3β、AKT(PKB)、AP-1、cyclinD1、MMP9、VEGF、β-catenin mRNA及蛋白的表达下降。结论：① ILK基因参与了肺癌细胞A549凋亡、迁移和成瘤细胞生物学过程，沉默ILK基因后可以明显降低GSK-3β、VEGF的表达，10%的中药肺岩宁方含药血清可能通过下调靶基因AP-1、cyclinD1、MMP、VEGF和β-catenin蛋白表达的作用而发挥其抗肿瘤的作用；②裸鼠成瘤模型证明沉默ILK基因后，具有显著调控下游靶基因Akt、AP-1、 cyclinD1、GSK-3β、MMP9、VEGF、β-catenin表达的作用，ILK基因通过调控细胞周期、基质金属酶的降解、肿瘤血管的的生成及细胞粘附等参与肺癌的形成、转移过程。