水稻(Oryza sativa)花粉中两个特异启动子的克隆及元件功能验证

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，其花粉发育过程与育性和产量密切相关。对水稻花粉发育功能基因的研究，最好是在花粉特异表达启动子的驱动下进行，但关于水稻花粉特异表达启动子的报道较为少见。本研究从水稻中克隆了两个花粉特异启动子并拟通过5`端缺失和swap实验对其进行功能元件的验证，试图发掘新的花粉特异顺式作用元件和激素诱导下的增强和衰减元件，为水稻花粉功能基因研究的多基因转化提供有力工具，同时为水稻雄性不育分子育种体系提供技术依据，并在理论指导下进一步设计水稻两系分子育种路线，探讨该组启动子在农业育种中的应用。另外，顺式作用元件的发掘和对拟南芥的转化工作，可能为"顺式作用元件变异是进化的重要动力"的进化发育生物学理论提供相应的实验证据。

我们利用GUS染色、截短缺失、序列拼接以及水稻的稳定转化等方法对水稻中的两个晚期花粉特异启动子Pollen-late-stage-promoter 1（PLP1）和Pollen-late-stage-promoter 2（PLP2）开展了深入的研究。组织化学染色的结果显示：PLP1启动子驱动GUS基因在花药发育的11-14期的花粉中表达，而PLP2启动子驱动GUS基因在花药发育的10-14期的花粉中表达。5’端逐渐缺失实验发掘出了四个对于维持花粉特异表达的活性和特异性非常重要的区段，包括：PLP1启动子中的-1159到-720和-352到-156区段，PLP2启动子中的-740到-557和-557到-339区段。突变实验结果表明PLP2启动子-740到-557区段之间的AGAAA和CAAT元件具有增强子活性。功能验证分析结果表明水稻PLP1或PLP2启动子核心区域新发现的TA-rich元件TACATAA或TATTCAT的存在，是维持启动子花粉特异性的必要非充分条件。这部分结果已申请并得到两个专利的授权（（ZL 201110038974.5，201110038981.5），文章已经投稿到Plant Biology Journal 杂志上。