甜樱桃‘斯坦拉’自交亲和性分子机制研究与自交亲和性种质创新

Higher plant self-incompatibility is determined by interaction between S-RNase in style and SLF in pollen.The style S-RNase and pollen SLF of sweet cherry show one-to-one relationship, which is a good model for self-incompatibility research.'Stella 'is the first commercial self-compatible variety, from which most self-compatible sweet cherry varieties are derived.Research suggest that 4 bp deletion existing in SLF4 in 'stella' should be the cause of self-compatibility. However, which still lack of direct experimental envidence.In this reaserch,the mechanism of self-compatibility in sweet cherry will be studied and new self-compatible variants will be created. Firstly, inactivition of SLF is the reason of self-compatibility will be confirmed through pollinating S3-SLF4′transgened pollen to S3S3 plant. Secondly, key region of SLF recogniting S-RNase should be confirmed by SLF step-cuting and fixed point mutation.Finally,inactived SLF3 will be built by deleting key recogniting region and new self-compatible variants will be created by self-pollinating of S3-SLF3′etc.

高等植物的自交不亲和现象是由花柱S-RNase和花粉SLF间相互识别决定的。樱桃的花柱和花粉S因子表现为一对一的关系，是研究自交不亲和机制的优良材料。'斯坦拉'是第一个商品化的自交结实甜樱桃品种，绝大多数自交结实品种均来源于'斯坦拉'。研究表明，'斯坦拉'的SLF4基因有4个碱基缺失（SLF4′），可能是导致自交亲和的原因，但缺乏直接的实验证据。本项目以'斯坦拉'（S3S4′）以及基因型为S3S3和S4′S4′的后代为试材，研究甜樱桃自交亲和的机制并进行自交亲和种质创新。首先，通过S3-SLF4′转基因花粉给S3S3植株授粉的方法，确定甜樱桃自交亲和是由于SLF4失活导致的。其次，通过对SLF4基因定向删减和定点突变，研究SLF识别S-RNase的关键区域。最后，通过将SLF3关键区域失活构建SLF3′，并通过S3-SLF3′等转基因花粉给S3S3等个体自交授粉，创建自交亲和新种质。

结题摘要：樱桃自交不亲和现象由花柱S-RNase和花粉SFB间相互识别决定，表现为一对一的关系。‘斯坦拉’是第一个商品化的自交结实甜樱桃品种，绝大多数自交结实品种均来源于‘斯坦拉’。研究认为，‘斯坦拉’的SFB4基因有4个碱基缺失（SFB4’）是导致自交亲和的原因，但这一推论缺乏直接的实验证据。本研究以‘拉宾斯’（S1S4’）、‘雷尼’（S1S4）、‘红灯’（S3S9）、‘21-21’ （S4’S4’）为试材，对S-RNase、SFB、SLFL等自交不亲和相关基因进行研究。首先，通过严谨的自交、异交授粉证实‘拉宾斯’属于花粉侧SFB4单倍型突变导致自交亲和，且通过一系列特异引物验证了S-RNase和SFB的紧密连锁性；其次，western blot表明突变体花粉中存在SFB4’蛋白；pull-down，双分子荧光互补（BIFC）和免疫沉淀证实SFB4’蛋白缺失部位是与S4RNase结合的关键区域；但花粉基因枪和原生质体瞬时转化证实SFB4定位于花粉管尖端且缺失突变不影响其蛋白定位；此外，寡核苷酸沉默花粉管内的SFB基因可解除重组S-RNase抑制自我花粉管的生长情况；为了进一步揭示SFB4’导致亲和性的作用机理，以SFB4蛋白为诱饵，从花粉总蛋白中筛选得到SSK、PavFB等多个与SFB互作蛋白，并对这些蛋白定位及互作情况进行了分析。总之，我们首次证明SFB4缺失突变导致其丧失与核酸酶在花粉管尖端的识别能力而出现自交亲和，PavFB、SLFL1、SLFL2等基因可能作为助因子参与自交不亲和反应的识别。