微生物在裸子植物小叶买麻藤虫媒传粉中的生态功能研究

Gymnosperms are generally considered to be pollinated by wind, yet insect pollination is prevalent in the phylogeny-specific genus Gnetum (Gnetales), whose pollination drops are secreted at night for the attraction of pollinating insects. There are now few studies on the pollination mechanisms of Gnetum, possibly because of the difficulties in nocturnal observation. Our previous study indicated that microbes occurred regularly in the pollination drop of Gnetum parvifolium, however, their roles on the insect-pollination process that remain relatively unexplored. Based on the preliminary results of population surveys, three populations (Hainan, Yunnan and Guangdong) with distinct pollinator diversitys will be chosen to conduct studies on the ecological functions of microbes on the insect pollination of G. parvifolium. We will use cultivation-dependent and -independent (high-throughput sequencing) techniques to study microbial community structure in the pollination drop. Multi-year field experiments will be conducted to explore the relationships among environmental factors, plant reproductive traits, pollinator diversity and microbial community structure. In addition, microbial inoculation (important strains and their combinations) and gas chromatography-mass spectrometry will be used to determine the influence of microbe-mediated variation in the chemical composition of pollination drop on pollinator foraging and subsequent plant reproductive fitness. The project aims to reveal the patterns of adptation and evolution in the insect pollination of G. parvifolium. Furthermore, relevant results can be used as reference data for the conservation of this rare and endangered plant species.

裸子植物一般为风媒传粉，但具特殊系统位置的买麻藤属（Gnetum）植物却普遍为虫媒传粉。由于其传粉滴分泌和昆虫访问均在夜间发生，相关传粉机制研究仍十分缺乏。我们的前期研究表明小叶买麻藤（Gnetum parvifolium）传粉滴中含有大量微生物，这些微生物与传粉者存在何种互作，也有待深入研究。基于前期居群调查结果，本项目拟选择三个具有不同传粉者多样性的小叶买麻藤居群（海南、云南和广东），深入研究传粉滴微生物在其虫媒传粉过程中发挥的生态功能。计划通过纯培养和高通量测序相结合的手段全面鉴定传粉滴微生物群落结构，探寻其与环境因子、植物繁殖特征和传粉者多样性之间的关系；运用微生物接种和色谱-质谱法，检验关键菌种及菌种组合代谢作用所导致的传粉滴化学成分的改变，对传粉者行为和植物生殖适合度的影响。项目的实施将为濒危植物小叶买麻藤的保护提供参考资料，也将有助于探索买麻藤属植物虫媒传粉模式的适应和进化。

自然界中，微生物虽肉眼难辨却又无处不在，并在不同生境以及生物互作过程中发挥着重要的生态功能。例如裸子植物的传粉滴和被子植物的花蜜在发挥花粉捕获功能和传粉者报酬的同时，也因富含糖类和氨基酸而成为了微生物潜在的天然培养基。微生物在此类高营养生境中的传播、增殖、消亡和代谢活动，均可能对传粉滴/花蜜性状、传粉者行为、传粉过程以及随后的植物生殖适合度产生复杂的影响。本研究在虫媒传粉植物预实验的基础上对小叶买麻藤开展室内外的研究，以揭示微生物在植物-传粉者相互作用中的生态功能。主要结果如下：.首先，为计算虫媒和风媒传粉的相对生殖贡献，我们对海南和深圳居群进行了四种传粉处理并统计胚珠膨大率。两居群的膨大率结果类似：套袋组均为零，说明小叶买麻藤不存在无融合生殖；补充授粉组显著高于自然组，说明该物种存在花粉限制；自然组高于套袋组，说明其需要一定的传粉媒介来确保生殖成功；套网组显著低于自然组，但高于套袋组，说明虫媒和风媒传粉在小叶买麻藤中均存在。同时，虫媒传粉对其生殖贡献率在两个居群中也基本一致，均为80%左右。.其次，我们以甘川铁线莲为材料开展预实验，以熟悉随后微生物气味影响买麻藤与传粉者的相互作用研究。结果发现海洋酵母菌在该种植物的花蜜中具有较高的发生率和密度。我们在野外使用人工花蜜对甘川铁线莲的自然花进行酵母接菌和无菌对照处理，通过比较不同处理组间传粉者访花行为和植物生殖适合度的差异，证明了海洋酵母菌可以显著提高传粉者红腹熊蜂的访花频率和甘川铁线莲的结籽率。此外，通过对微生物发酵后花蜜气味的气质联用测定，我们发现海洋酵母菌能够产生如2-甲基-1丁醇等四种挥发性代谢物，这些气味分子可能作为吸引传粉者访问的有效花信号，促进甘川铁线莲和红腹熊蜂之间的相互作用。.最后，我们运用气质联用对裸子植物小叶买麻藤雌球花序的气味进行了定性定量分析，发现其酸性腐败菌类气味由四种挥发性短链脂肪酸组成，即乙酸、丙酸、异丁酸和异戊酸。通过昆虫行为实验证实，这种菌类气味对其两类最重要的传粉功能群（蛾类和蟑螂）均具有明显的吸引作用。此外，我们采用高通量测序的方法全面解析了小叶买麻藤传粉滴内细菌的多样性组成，发现传粉滴中的优势菌群，即普氏菌属和拟杆菌属微生物均具有代谢糖类和氨基酸而产生上述脂肪酸的能力，因此在其传粉过程中可能作为功能菌群，促成气味信号的形成以吸引有效传粉者的访问。