基于livin介导的胶质瘤干细胞抗凋亡通路与化疗耐药机制

申请者在既往研究中，发现livin 基因介导的抗凋亡通路与胶质瘤化疗耐药之间关系密切，但查阅大量国内外相关文献，尚未见到对此机制的系统研究报道。课题组依据先前的试验结果和国内外同行专家研究肿瘤干细胞化疗耐药的理论推断，胶质瘤干细胞通过livin基因过表达关闭抗凋亡诱导通路，阻断死亡信号转导，导致胶质瘤的化疗耐药。为了验证上述推论，课题组拟建立胶质瘤干细胞转化模型和胶质瘤干细胞动物转化模型，采用慢病毒过表达、RNA 干扰、实时荧光定量RT-PCR 和化疗药物干预等技术和手段，对胶质瘤干细胞和胶质瘤细胞U251进行干预，探明livin介导的抗凋亡诱导通路，分析化疗药物干预对livin抗凋亡通路相关基因和化疗耐药基因的影响及其机制，进而从肿瘤干细胞理论角度揭示肿瘤耐药的根源，丰富和发展肿瘤干细胞理论，为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法，并为攻克胶质瘤的化疗耐药治疗难关奠定坚实的理论和实验基础。

课题组从细胞水平、动物水平两个层面，结合肿瘤干细胞学说和抗凋亡基因过表达理论，通过慢病毒转染技术、RNA干扰等技术，同时构建胶质瘤干细胞细胞模型和动物模型，用不同药物浓度的替莫唑胺在不同时间点干预所构建模型，检测livin介导的抗凋亡通路相关基因和化疗耐药基因的变化规律及药物影响机制。. 研究结果发现肿瘤细胞livin含量越高，细胞增殖越快；替莫唑胺能抑制livin基因表达，随着药物浓度加大，抑制效果增强，肿瘤细胞增殖受到抑制。同时与livin基因关系密切的caspase-3，7,9、MRP1、MRP3、ABCB1 、ABCG2、TNF-amRNA随着livin基因的改变而发生改变，化疗药物干预后，胶质瘤干细胞表现出更强的抗凋亡和耐药特性，livin介导的抗凋亡通路相关基因发生相应变化，提示livin在胶质瘤抗凋亡通路中发挥重要作用。. 本研究建立了人脑胶质瘤细胞U251及其干细胞裸鼠大脑种植瘤模型，成瘤率均为100%，未见颅外转移病灶，瘤细胞病理性核分裂像多见，GFAP和CD34呈阳性表达，瘤组织内有出血和坏死以及丰富的微血管，在组织病理学上接近人脑胶质瘤病理学表现，但胶质瘤干细胞组较U251细胞组表现出更强的恶性特征；应用替莫唑胺干预裸鼠脑内种植瘤模型，结果显示U251及其干细胞自然表达动物模型MRP1的表达均随药物浓度升高及干预时间增加呈上升趋势。但siRNA-Livin后建立的胶质瘤干细胞动物模型，随着药物浓度升高，MRP1出现下降趋势。胶质瘤干细胞动物模型较U251细胞动物模型表现出更强的化疗耐药特性，其Livin介导的抗凋亡通路相关基因表现了与细胞水平实验表现了异质性。. 从人脑胶质瘤细胞U251中成功分离培养了胶质瘤干细胞，并能在体外进行增殖和分化，这为进一步研究胶质瘤干细胞生物学特性提供实验载体。成功建立了胶质瘤干细胞动物模型，为胶质瘤及其干细胞病因学、基因治疗或药效学等研究提供有效的实验模型。课题组综合分析实验结果后，提出了干细胞在分化和去分化过程中，耐药基因表达的不确定性，以及多个耐药基因的表达不平衡，优势基因和非优势基因的协同作用，才能真实反映肿瘤耐药的真实程度，肿瘤干细胞不是造成肿瘤耐药的惟一因素。