Nrf2/ARE防御系统在雷公藤肝毒性中的作用及机制研究

肝毒性是雷公藤常见的不良反应，氧化应激损伤为其主要毒性机制之一。近年研究表明Nrf2/ARE是机体抗氧化应激的重要防御性转导通路，我们前期研究发现它参与了机体对雷公藤所致肝毒性的自我防御，但具体作用和机制尚不清楚。本课题拟采用流式细胞术、实时荧光定量PCR、western blot、细胞转染、siRNA介导基因表达沉默等技术与方法，利用体外细胞和整体动物模型，从单体、组分、提取物三个层次，以"Nrf2/ARE驱动的防御系统"为轴线，分析雷公藤致原代肝细胞氧化应激和毒性作用特点，由Nrf2表达和核转位、Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶/蛋白表达等多环节探讨该通路对雷公藤暴露应答的量效-时效特征，对Nrf2基因抑制或过表达、加入Nrf2诱导剂或下游靶基因产物酶特异抑制剂预处理时观察肝毒性作用变化，进而揭示Nrf2/ARE防御系统在雷公藤肝毒性中的作用及分子机制，并为雷公藤的控毒减毒提供新靶点和新思路。

近年来研究表明Nrf2-ARE防御系统与氧化应激及细胞保护密切相关，在对抗外源物引发的肝、肾损伤中发挥着重要的保护作用。本研究探讨雷公藤肝、肾毒性的作用机制，深入研究了Nrf2-ARE防御系统在雷公藤肝、肾毒性中的作用及分子机制，并以Nrf2作为新靶点寻找能够对抗雷公藤肝、肾毒性的保护性药物，旨在为雷公藤的配伍减毒及临床合理用药提供更加充分的依据。. 首先，本研究考察了雷公藤多苷提取物和其代表性单体成分雷公藤甲素对肝细胞和肾细胞的氧化应激和毒性损伤特点，发现雷公藤提取物和代表性单体雷公藤甲素可以诱导细胞氧化应激损伤，其中肝细胞对其毒性更加敏感。然后，在体外细胞水平考察了Nrf2/ARE防御系统在雷公藤代表性成分致肝细胞和肾细胞毒性损伤中的作用和分子机制。研究发现雷公藤代表性成分雷公藤甲素能够应激性地增加肝细胞和肾细胞中Nrf2转位入核的水平，同时荧光报告基因实验结果显示其可以增加ARE活性，并诱导Nrf2下游靶基因NQO1、GCLC和HO-1的表达，这种作用呈现一定的量效时效依赖性，随着时间增加，由于其毒性作用增强，进而又下调Nrf2的表达。通过在细胞中转染Nrf2表达质粒过表达Nrf2后，雷公藤甲素对肝细胞和肾细胞的氧化应激损伤和毒性作用减弱。siRNA干扰Nrf2后，雷公藤甲素在细胞中引起了更大程度的细胞活性下降，细胞形态学改变更加显著，ROS的诱导与GSH的含量下降也更加明显。结果表明，雷公藤甲素在细胞水平可以应激性激活Nrf/ARE防御系统，通过对抗氧化应激，减弱雷公藤的肝肾细胞毒性作用。最后，在体内整体动物水平，考察了Nrf2的经典激动剂莱菔硫烷是否能够通过激活Nrf2-ARE防御系统减轻雷公藤对BALB/C小鼠的急性肝、肾损伤，为雷公藤的配伍减毒提供参考。研究发现，Nrf2激动剂莱菔硫烷可以诱导肝脏、肾脏组织中Nrf2转位入核及其下游靶基因NQO1、GCLC、HO-1的表达水平，增强肝脏、肾脏组织中的抗氧化酶活性，对抗雷公藤引起的肝肾毒性。同时，通过建立Nrf2双荧光素酶报告基因体系筛选天然产物分子，研究发现丹参酮IIA可以激动Nrf2/ARE防御系统，从而减轻雷公藤造成的肝毒性。综上，本研究揭示了Nrf2/ARE防御系统在雷公藤肝毒性和肾毒性中的作用和分子机制，为以Nrf2为靶点的雷公藤配伍减毒研究提供了科学依据和基础研究资料。