Pigmentiphaga sp.D-2降解新型烟碱类杀虫剂啶虫脒分子机理的研究

啶虫脒残留的毒害问题已日益受到世界各国的重视，在分子水平上阐明啶虫脒微生物降解的分子机理对微生物修复具有重要的指导意义。本项目拟以降解性状优良的菌株Pigmentiphaga sp.D-2为研究对象，采用GC-MS、LC-MS/MS等方法，初步推测其降解啶虫脒的途径，借助高通量测序平台获取菌株D-2的基因组序列（Pigmentiphaga属菌株还未见基因组序列报道），运用生物信息学预测并结合试验验证、转座子随机插入突变及酶的纯化和测序等方式，克隆参与啶虫脒降解的关键酶基因，在分子水平上阐明啶虫脒的完整代谢途径，填补啶虫脒降解机理方面的空白，为对该菌株进行稳定性遗传改造和氯代新型烟碱类杀虫剂污染环境的修复提供重要的技术支持，具有很好的科学价值和应用潜力。

为消除啶虫脒对生态环境造成的破坏，本项目开展了微生物对啶虫脒降解的分子机理的研究，取得以下结果：1、分离啶虫脒降解多株， D-2和AAP-1鉴定为Pigmentiphaga sp.，D-12鉴定为Ochrobactrum sp.， AAP-7鉴定为Pseudoxanthomonas sp.。2、啶虫脒降解代谢途径的研究。通过FT-IR、GC-MS和NMR等技术，对菌株AAP-1降解过程中的一个N-脱乙酰代谢产物进行了鉴定；菌株AAP-7通过水解或脱甲基化降解啶虫脒形成中间代谢物（E）-3-（（（6-氯吡啶-3-基）甲基）（甲基）氨基）丙烯腈和N-（（6-氯吡啶-3-基）甲基）-N-甲基丙-1-烯-2-胺，然后均转化为终产物1-(6-氯吡啶-3基)-N-甲基甲胺；利用串联质谱和LC-MS分析，鉴定了菌株D-2降解啶虫脒过程的三个代谢产物，分别为N-甲基-(6-氯-3吡啶基)甲基胺、N-(6-氯-3-吡啶)甲基-Nl-甲基乙脒和N′-氰基-N -甲基-N-(吡啶- 3 -亚甲基）亚氨基甲酰胺。另外，菌株D-2可以通过脱乙酰基作用，将产物N-(6-氯-3-吡啶)甲基-Nl-甲基乙脒转化为N-甲基-(6-氯-3吡啶基)甲基胺。据我们所知，本研究首次报道了啶虫脒代谢过程中的一个脱氯的代谢产物N′-氰基-N -甲基-N-(吡啶- 3 -亚甲基）亚氨基甲酰胺。3、菌株D-2在未灭菌土壤中的降解效果要略好于灭菌土壤，该菌株能有效降解土壤中1～200 mg/kg的啶虫脒。啶虫脒施用对土壤种群结构有一定的影响，可以刺激细菌和真菌的生长，从而使土壤微生物群落结构发生改变，而降解菌的施用可缓解啶虫脒对土壤微生物的影响，修复受污染土壤。4、接种AAP-1对土壤中啶虫脒的降解效应及土壤细菌多样性的影响。与未接种AAP-1到啶虫脒污染土壤相比，接种该菌的土壤啶虫脒降解速率较快，通过T-RFLP分析显示，接种菌株AAP-1使得啶虫脒土壤污染区的细菌群落系统得以恢复。从这些结果可以看出，菌株AAP-1在啶虫脒污染环境的生物修复过程中具有较大的应用潜力。5、采用基因组文库构建和高通量测序技术同时克隆菌株D-2降解啶虫脒的关键酶基因，已获得2个阳性克隆子及啶虫脒突变菌株，相关研究工作正在进行中。总体来说，本项目取得了预期结果，共发表论文12篇，其中SCI收录4篇。