白桦BplMYB46基因的上游调控机制及调控因子的功能研究

The BplMYB46 gene was cloned from Betula platyphylla, our previous study suggest that it can enhance stress tolerance, and regulate the expression of target genes, but its upstream mechanism is not clear. In the present study, the BplMYB46 promoter was cloned and fused with a reporter gene, and then will be transformed into birch via Agrobacterium. After stress treatment, the activity of the BplMYB46 promoter will be analyzed by detecting the expression level of the reporter gene. At the same time, the upstream regulators will be identified using yeast one hybrid technology based on the cis-acting elements, and further verified by transient expression, chromosome immunoprecipitation and qRT-PCR. The overexpressing and silencing of the upstream regulator will be performed in order to analyze its function by phenotypic and physiological indexes. These results should clarify the upstream regulatory mechanism of BplMYB46 and the function of its upstream regulator, and will also provide the theoretical and practical basis for the molecular breeding of new varieties of forest trees.

我们从白桦体内克隆获得一个BplMYB46基因，前期的研究表明该基因能够提高白桦的抗逆能力，并能调控下游基因的表达，但其上游调控机制还不清楚。目前，我们已经把BplMYB46基因的启动子克隆出来，并与报告基因融合，接下来拟利用农杆菌介导法转化白桦，然后对转启动子白桦进行胁迫处理后，通过对报告基因表达水平的检测分析启动子的活性。同时根据启动子上含有的顺式作用元件，利用酵母单杂交实验获得BplMYB46基因的上游调控因子，并利用瞬时表达、染色体免疫共沉和实时荧光定量PCR技术进一步验证，将获得的上游调控基因进行过表达与抑制表达的转白桦实验，通过表型和生理指标等实验分析上游调控因子的功能。通过以上研究，深入的阐明BplMYB46基因调控白桦抗旱耐盐的上游调控机制和上游调控因子的功能，为利用分子生物学手段进行林木新品种培育提供理论和实践依据。

MYB转录因子在植物的生长发育中起着重要的调控作用，我们从白桦体内获得一个BplMYB46基因，前期的研究表明，该基因可以增强白桦对盐和渗透胁迫的耐受性、参与次生壁的合成，调控下游基因的表达，并阐明其下游调控机制，然而，其上游调控机制还未被揭示。在本项目中，首先把BplMYB46基因启动子与报告基因融合，利用农杆菌介导法转化白桦，然后进行盐和渗透胁迫处理后，检测GUS报告基因表达量和相对GUS酶活，结果显示，BplMYB46启动子能够响应盐和渗透胁迫。构建白桦cDNA文库，根据BplMYB46启动子上含有的Dof、MYC、ABRE和W-box顺式作用元件，利用酵母单杂交技术获得八个上游调控因子：BplDof1、7、10、12和BplbZIP3、4、5以及BplWRKY3，并利用ChIP-PCR和qRT-PCR实验进行验证，结果证实八个上游调控因子分别通过与Dof、ABRE和W-box顺式作用元件结合调控BplMYB46基因的表达。将野生型白桦分别进行盐和渗透胁迫，利用qRT-PCR技术，结果发现这八个上游调控因子能够受盐和渗透胁迫诱导表达；将它们分别与GFP融合，基因枪瞬时侵染洋葱表皮，结果显示它们都定位在细胞核中。选取在盐和渗透胁迫下，表达差异显著的一个基因BplDof1，进行获得和缺失该基因的功能分析。结果表明，BplDof1基因能够提高SOD和POD活性以降低ROS积累，并降低了细胞死亡率，进而能够增强白桦的抗逆能力。本研究阐明了BplMYB46基因调控白桦耐盐、抗渗透胁迫的上游调控机制，并初步探究了BplDof1基因的功能，对发掘具有调控白桦耐盐、抗渗透胁迫的优质基因以及林木新品种培育提供前期基础数据。