调控Bmovo基因表达干扰家蚕卵巢发育对丝蛋白合成的影响

为了明确Bmovo基因表达对家蚕卵巢发育的影响，探讨卵巢发育与丝蛋白合成的关系，并最终实现通过基因操作抑制卵巢发育，提高家蚕产丝量，本项目拟在我们已成功克隆Bmovo基因和已建立的转基因系统的基础上，利用合成的Bmovo-dsRNA，通过RNAi抑制Bmovo表达、用生殖细胞特异性启动子控制Bmovo cDNA,通过piggyBac介导的转基因过表达Bmovo、用Bmovo基因组的部分序列构建基因打靶载体，通过同源重组敲除Bmovo，研究下调、上调和缺失Bmovo表达对蚕卵巢发育和造卵的影响，明确Bmovo的功能；在此基础上，研究调控Bmovo基因表达干扰卵巢发育对雌蚕产丝量的影响。本项目不仅在理论上可探明Bmovo基因在家蚕卵巢发育中的功能，明确卵巢发育是否影响丝腺的发育和产丝量，而且可为通过抑制卵巢发育提高雌蚕产丝量提供理论基础和技术支撑，也可为通过雌性不育防治鳞翅目害虫提供新的途径。

为了探讨调控家蚕ovo(Bmovo)基因的表达干扰卵巢发育对丝蛋白合成的影响，课题组按计划任务书开展了相关研究，完成了相关研究内容。共发表SCI论文13篇，申请专利8件，培养研究生13名。取得的主要结果如下：克隆到了Bmovo基因的4种剪接体Bmovo-1 (GU477588), Bmovo-2 (HQ831344), Bmovo-3 (HQ831345) 和 Bmovo-4 (JQ665224)，信息学分析显示BmOVO-1, BmOVO-2 和BmOVO-3有4个C2H2型锌指结构域，但N-端有明显不同。BmOVO-4仅有1个C2H2型锌指结构域。Bmovo-1 和 Bmovo-2在卵巢中表达水平最高，Bmovo-3 和 Bmovo-4主要在卵巢和丝腺中表达。Western检测发现在精巢和卵巢中均可以检测到BmOVO-1和BmOVO-2，BmOVO-4仅在精巢中检测到，BmOVO-3仅在卵巢中检测到。组织免疫荧光结果显示，在滤泡细胞、护卫细胞、初级卵母细胞以及不同发育阶段的精细胞中均可以检测到BmOVO。下调Bmovo基因表达导致产卵量下降15%，茧层量提升10%；转基因家蚕卵巢过表达Bmovo-1基因导致蛹重、茧层量分别下降11.29% 和 18.11%，产卵量提高13.37%。qPCR证实过表达Bmovo-1基因，可提高卵巢中的otu, sxl-L 和achi及精巢中的out，sxl-S的表达，下调丝腺fib-L基因的表达，血淋巴和卵巢中海藻糖的水平分别提升11.37% 和 10.56%。转录组测序结果显示，转基因家蚕卵巢过表达Bmovo-1基因导致123个基因表达上调，111个基因表达下调(FDR<0.001)，差异表达基因的功能主要富集在胞外基质和胞外间隙；KEGG分析指出，差异表达基因主要与新陈代谢、遗传信息加工、环境信息加工、细胞进程和机体系统有关。推测卵巢过表达Bmovo-1，增强了卵巢和卵子发育过程中的合成代谢水平，促进了卵细胞增殖、存活和营养物质向卵巢转运，导致转基因家蚕产卵量增加、丝蛋白合成减少。以Bmovo基因的左右臂序列为同源臂构建了基因打靶载体，进行了基于同源重组的基因敲除，获得了转基因家蚕，开展了基于Talen和Cas9技术敲除Bmovo基因研究，通过Talen技术与同源重组技术相结合初步获得了转基因家蚕。