绿僵菌MabrlA基因在产孢调控中的作用研究

绿僵菌是重要的生防微生物。在前期研究中发现，绿僵菌的1个编码C2H2型锌指转录调控因子的EST在产孢细胞形成期上调表达。该转录因子与构巢曲霉产孢调控蛋白brl具有同源性，brlA基因在丝状真菌产孢调控中起着中心调控作用。利用刚完成的绿僵菌全基因组序列数据库，找到了该基因（Mabr1A）及其它7个产孢调节基因的全长序列。本项目将克隆MabrlA全长基因序列、启动子及其系列5'端缺失序列，构建绿僵菌MabrlA超表达转化子、敲除转化子和MabrlA不同长度启动子控制的GUS基因表达转化子，研究MabrlA对产孢的影响，分析该基因在产孢过程中的表达特性以及该基因的调控序列与调控特征，弄清MabrlA与其它产孢调节基因之间的调控关系，阐明MabrlA在绿僵菌产孢调控中的作用机制。本项研究可望为提高孢子生产提供新的理论依据和技术途径，对于充分挖掘昆虫病原真菌在害虫防治中的巨大潜力具有重要意义。

昆虫病原真菌主要通过体壁侵染昆虫，在害虫持续控制及维护物种多样性方面具有特殊优势。分生孢子是昆虫病原真菌的主要侵染体，也是杀虫真菌类农药的主要有效作用单元。产孢也是丝状真菌适应环境（温度、营养、pH等）的重要过程，研究产孢分子调控机制，对于充分挖掘昆虫病原真菌在害虫防治中的巨大潜力具有重要意义。.本研究利用完成的绿僵菌全基因组序列数据库，克隆绿僵菌到8个产孢相关基因MaBrlA、MafadA、MawetA、MaflbC、MasfgA、 MaflbB、MaflbD和MafluG，并分别构建这些基因的绿僵菌转化子。通过表型分析证明这些基因对绿僵菌的菌丝生长和产孢产生明显影响，其中，MaBrlA、MawetA对绿僵菌在CM（完全培养基）、MM（基本盐培养基）和1/4SDA（富营养培养基）上的产孢都具有明显影响；MaflbB对绿僵菌在含有微量元素的培养基上的产孢具有明显影响；MafadA对绿僵菌在含有山梨醇的培养基上的产孢具有明显影响；MafluG对绿僵菌在CM（完全培养基）上的产孢具有明显影响。通过分别对敲除转化子其他产孢基因的表达量的变化，初步阐明绿僵菌产孢途径：MafluG处于调控途径上游，对MaBrlA、MafadA、MawetA、MaflbC、MaflbB起着正调控，对MasfgA起着负调控；MaBrlA、MawetA处在产孢途径下游，直接对产孢产生影响；MasfgA对MaBrlA、MafadA、MawetA、MaflbC、MaflbB起着负调控；afadA、MaflbC、MaflbB、MaflbD处于调控中游，以不同路径调控MaBrlA和MawetA。.同时，对MaBrlA基因功能进行研究，发现MaBrlA敲除后，绿僵菌孢子在翅膀上的萌发和附着胞的形成显著下降，的侵染毒力丧失，但孢子耐热与抗紫外特性与野生菌种无显著差异。 .利用基因敲除和基因回复的方法对产孢模式相关基因pp5基因（一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基因）的功能研究发现：pp5基因对绿僵菌的产孢量、抗湿热能力、抗紫外能力起负调控作用，对孢子的形态均一性起正调控作用，对绿僵菌的毒力没有显著影响。