新型溴代阻燃剂五溴甲苯对斑马鱼的神经毒性效应及分子机制研究

Pentabromotoluene (PBT), a novel brominated flame retardant, is widely used and distributed in the environment and organisms in China. However, its toxic effects and environmental health risks are not well-known. Using molecular docking simulation calculation, we found that PBT and acetylcholinesterase (AChE) could form a relative stable complex. The results of in vivo study from zebrafish experiment showed that PBT inhibited AChE activity and caused neurobehavioral toxicity. In this project, zebrafish will be selected as a model for further understanding the toxic effect and molecular mechanism of PBT; We will investigate the toxicokinetics of PBT, identify the key target related to central nervous system development, neurotransmitters and AChE. Based on Bio-Layer Interferometry (BLI), the binding kinetics will be performed though the assays of affinity and binding and dissociative pattern of PBT and AChE. Using CRISPR-Cas9, we will explore the acetylcholine receptor (AChR) in mediating role of PBT-induced neurotoxicity. The overall study will be contributed to understanding the toxicity and environmental health risk assessment of emerging toxicant.

五溴甲苯（PBT）是我国大量生产和使用的新型溴代阻燃剂（NBFRs），广泛存在于环境和生物体内，但其毒性效应和环境健康风险了解甚少。申请人利用分子对接模拟计算表明，PBT可与乙酰胆碱酯酶（AChE）形成较稳定的复合物，斑马鱼活体实验证实PBT可抑制AChE活性，并引起神经行为毒性。为深入了解PBT毒性效应及作用的分子机制，本项目拟以斑马鱼为模式动物，研究PBT对斑马鱼的毒代动力学，阐释其毒性发生和发展的规律；探究PBT对斑马鱼中枢神经系统发育的关键基因、神经递质及AChE的影响，明确PBT暴露引起斑马鱼神经行为毒性的关键靶点；基于生物膜干涉技术，检测PBT和AChE的亲和力和结合解离模式，揭示PBT和AChE的结合动力学过程；利用CRISPR-Cas9技术，探究乙酰胆碱受体（AChR）在PBT神经毒性过程中的介导作用，阐明PBT致毒的分子机制。研究结果可为PBT的生态环境风险评价提供科学依据。

单环芳烃类新溴代阻燃剂五溴甲苯（PBT）、六溴苯（HBB）和五溴苯（PBB）是我国大量生产和使用的新溴代阻燃剂（EBFRs），广泛存在于环境和生物体内，但对它们的毒性效应和环境健康风险了解甚少。因此，以斑马鱼为受试生物，研究了PBT、HBB和PBB的神经毒性效应和分子机制。结果表明， PBT、HBB和PBB染毒对斑马鱼均未引起明显的致畸效应，这表明它们急性毒性较低。但是，斑马鱼神经行为测试发现300μg/L HBB、100、300μg/L PBB和PBT显著降低了活力及光暗周期反应能力，这表明PBT、HBB和PBB具有神经毒性。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测了PBT、HBB和PBB在斑马鱼中的毒代动力学过程。结果表明PBT、HBB和PBB在斑马鱼体内的蓄积含量均随染毒浓度的增大而增加，不仅产生了脱溴代产物，还产生了毒性更大的羟基代谢产物——五溴苯酚（PBP）。此外，PBT、HBB和PBB均显著改变了中枢神经发育关键基因（ache、α1-tubulin、mbp、gfap、gap43）及蛋白（gap43、α1- tubulin和mbp）表达量。因此，PBT、HBB和PBB可能通过细胞骨架调控、神经元成熟、轴突生长和神经元分化等非靶标途径，诱导了神经毒性作用。分子对接模拟计算表明PBT、HBB和PBB可与乙酰胆碱酯酶（AChE）的相互作用，它们都能与TRP304的残基形成π-π相互作用，与PHE313形成卤素键，形成最优复合物的结合自由能分别为-25.5 kJ/mol、-24.3 kJ/mol和-23.4kJ/mol。斑马鱼活体实验证实PBT、HBB和PBB可抑制AChE活性，并增加了斑马鱼体内神经递质ACh含量，降低了Ch含量。PBT、HBB和PBB、以及它们的脱溴产物均未与AChE结合。但是它们的羟基代谢产物五溴苯酚 (PBP)在体外可与AChE结合，其中亲和力（KD）为157μM，结合速率（ka）和解离速率（kd）分别为133 μM-1S-1和2.09 S-1。通过加入烟碱型乙酰胆碱受体 (nAChR) 激动剂和抑制剂，发现PBT作用的nAChR为N1型。可见，PBT、HBB和PBB引起神经毒性，不仅与乙酰胆碱能系统和中枢神经系统发育受损有关，还与它们在体内生成毒性更大的羟基产物有关。该研究结果可为PBT、HBB和PBB的环境风险评价提供科学依据。