异黄酮对生长猪的促氧化作用及其机理研究

异黄酮是一种理想抗氧化剂，但近年来发现饲粮中过量添加则发生促氧化作用，造成畜禽生产性能、肉质下降等，其作用机理尚不明确。本项目拟开展：（1）添加不同剂量异黄酮，建立异黄酮对生长猪的抗氧化/氧化平衡系数；（2）添加高剂量异黄酮，研究其对生长猪机体GSH代谢影响的机制；（3）通过细胞培养试验研究高剂量异黄酮通过GSH代谢、MAPK信号通路影响细胞氧化损伤的机制；（4）通过动物试验，验证提出的抗氧化/氧化平衡系数与猪肉质、生长性能及免疫力之间的相关性。研究结果将(Ⅰ)阐明异黄酮影响GSH代谢、MAPK信号转导通路的机理，揭示高剂量异黄酮导致生长猪生长性能、抗氧化性能下降及肉质变差的促氧化作用机制；（Ⅱ）提出异黄酮对生长猪的抗氧化/氧化平衡系数，确定异黄酮发挥促氧化作用的临界浓度及适宜添加量。研究成果丰富和发展了异黄酮的抗氧化/促氧化作用理论，为异黄酮作为抗氧化剂在畜牧生产上合理应用提供科学依据

本项目拟用动物试验验证异黄酮的促氧化现象，并在细胞学试验中探讨其潜在机制。本研究首先开展了肥育猪饲喂高剂量异黄酮试验，发现高剂量异黄酮组血浆和背脂中MDA浓度显著高于对照组（P < 0.01），腹脂与肝脏中MDA浓度呈现高于对照组的趋势（P = 0.09），证实了生产动物摄入高剂量异黄酮也可造成促氧化现象。进而，采用不同浓度异黄酮（0、5、10、25、50、100、200、400 μM）处理猪原代骨骼肌细胞3 d发现，细胞中氧化平衡系数在5μM时值最低，而随着浓度上升氧化平衡系数逐渐上升；且细胞中MDA浓度亦表现相似的变化趋势，这表明较高浓度异黄酮对骨骼肌细胞表现出促氧化效应。通过筛选出5μM、200μM异黄酮处理骨骼肌细胞12、24、48 h后发现，相比对照组，200 μM异黄酮显著降低了12h，48 h的细胞膜流动性（P < 0.05），而5μM异黄酮无显著影响；且200 μM异黄酮处理骨骼肌细胞48 h后显著提高了骨骼肌细胞和培养基中活性氧水平（P < 0.05），从而表明高剂量异黄酮在骨骼肌细胞中促进活性氧的产生。再次用5 μM、200 μM异黄酮处理骨骼肌细胞24、48 h，结果发现，200 μM异黄酮显著降低了24和48h时细胞内促氧化酶基因NOX-4，COX1和COX2 mRNA表达（P < 0.05），而同时上调了促氧化酶基因5-LOX mRNA表达（P < 0.05）与谷胱甘肽抗氧化系统（P < 0.05）。进一步通过预处理5-LOX抑制剂（Zileuton）能降低细胞中由高剂量异黄酮所介导的活性氧的生成。本研究结果表明，高剂量异黄酮可通过5-LOX促活性氧的产生发挥促氧化作用，而同时反馈性抑制促氧化系统的相关酶，并激活GSH等还原酶系统。