单细胞三维成球培养对人脐带间充质干细胞的优化及其作用机理研究

Umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs) have many advantages such as extensive sources, multi-linage differentiation potential, hematopoietic support, low immunogenicity and self-renewal; therefore they are widely used in clinical treatment on various diseases and regenerative medicine. But the clinical practice facing many problems, such as huge cell quantity for injection, heterogeneity, low survival ability in vivo, the characteristics change in 2D (two-dimension) culture. 3D (three-dimension) culture was believed as an optimized system to mimic in vivo conditions. But, the clinical application of traditional 3D spheroids was limited for their defects: big size against direct injection and inner cell death. Under self-renewal theory direction, based on cell chip and 3D culture techniques, we developed a novel approach to produce single cell derived sphere (SCDS) for UCMSCs. Compared with the 2D culture and traditional 3D spheroid, SCDS may have some merits to meet clinical demands, such as: small size for direct injection, stress resistance, stemness maintenance, in vivo homing, inflammation and immune response. The aim of this project is to verify and explore the merits of UCMSC SCDS, and evaluate the repair effect of SCDS to hepatic injury in animal model and explore the mechanism of SCDS’ function. Our study will provide high qualified UCMSCs for clinical application, biological print and organoid construction, and offer new insight and theory for stem cell optimization for application purposes.

脐带间充质干细胞(UCMSCs) 具有来源广泛、多向分化潜能、造血支持，免疫原性低和自我更新等特点，被广泛应用于多种疾病的临床治疗和再生医学研究。目前临床面临的主要问题是：细胞注射量大、异质性、体内存活能力差、二维（2D）培养改变细胞特征等。作为干细胞优化手段，三维 (3D)培养可以更好地模拟体内环境，但传统3D细胞球的缺陷限制了其临床应用，如：尺寸大不易直接体内注射、内球细胞死亡等。为克服这些问题，基于细胞自我更新理论、细胞芯片和3D细胞培养技术，我们设计开发了一种新颖的单细胞来源细胞球 (single cell derived sphere, SCDS) 制备方法，与 2D和传统3D细胞球相比、SCDS在很多方面有适于临床需求的优势，如：小的尺寸、胁迫耐受、干性维持、体内归巢、炎症和免疫反应等。本项目旨在验证和挖掘SCDS的各种优势，评价其对肝损伤的修复能力，和探索其行使功能的机理。

脐带间充质干细胞(UCMSCs)具有来源广泛、多谱系分化潜能、低免疫原性和自我更新能力等特点，在再生医学领域具有广阔的应用前景。然而，UCMSCs的临床应用仍面临着诸多挑战：如大量细胞需求、体内生存能力低、二维培养导致细胞原有特征丧失等。传统的3D培养虽然能模拟体内条件，但在临床应用中存在一定的局限性，如由于细胞球体积大，不能直接体内注射，易引起细胞球内部细胞死亡。在本项目中，我们开发了一种基于单细胞芯片上2D阵列和3D培养的UCMSCs单细胞成球 （SCDS）的新方法。与2D和传统3D培养相比，基于单细胞自我更新能力生成的SCDS具有体积小、生存和归巢能力强、抗缺氧胁迫能力强、干性维持能力强等优点，可满足临床对优质UCMSC的要求。此外，在动物体内，SCDS培养的UCMSC可促进血管生成，并对急性肝衰竭(ALF)和肺纤维化显示出更大的治疗潜力。我们的结果表明，SCDS培养可能是一种简单有效的优化UCMSCs的策略，以满足临床需求。.微血管网的构建是组织工程和细胞治疗面临的最大挑战之一。由于细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)良好的生物相容性、降解性和可控性，被作为模拟细胞微环境的理想生物材料广泛应用于组织工程中。本项目通过在宿主细胞中表达胶原结合结构域(CBD)融合因子基因，制备富集VEGFA和bFGF的功能性细胞来源的ECM生物材料。该材料可诱导hUCMSCs向内皮细胞分化，促进血管生成，进一步促进动物皮肤创面愈合。.因子梯度参与各种生理过程，如器官发育、组织损伤修复、干细胞迁移、血管生成和疾病发展，如肿瘤转移和炎症。组织工程的一个目标是制造带有梯度因子的功能化材料，模拟天然组织的组成、结构和功能的复杂空间分布。在本项目中，我们开发了一种具有基质细胞衍生因子-1 (SDF1α)连续梯度的片状ECM的制备方法。这种功能化材料可以引导hUCMSCs在其上定向迁移。这些能影响MSC细胞行为的生物材料有望广泛应用于组织工程和再生医学研究。