刺参夏眠期间基因表达抑制及表观遗传调控机理研究

夏眠是刺参行为生态学的重要特征，深入揭示其分子机理十分必要，而基因表达调控研究是刺参夏眠调控机理研究重要内容。拟以正常生长刺参及夏眠刺参消化道、肌肉、呼吸树等组织为研究材料，以454测序获得的大量EST序列为参考，采用Solexa测序技术，构建刺参各组织夏眠基因表达谱数据库，分析刺参夏眠期间不同组织基因表达抑制差异；结合刺参夏眠期间各组织表观遗传修饰水平检测（基因组DNA甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等），分析表观遗传修饰在刺参夏眠基因表达抑制调控中的功能；以构建的表达谱数据库及现有研究成果为基础，筛选刺参表观遗传调控关键基因，应用原位杂交、实时定量、免疫组化等技术手段对关键基因的时空表达进行分析；采用抗体阻断等技术，验证关键基因（蛋白）功能；从基因和蛋白水平描述刺参夏眠期间表观遗传调控过程，初步阐明刺参夏眠基因表达抑制表观遗传调控机理。

刺参是典型的温带物种，当海水温度升高到一定范围时，刺参会隐藏于较深较安静的海底进入夏眠。这一习性无疑大大延长了刺参养殖周期，增加了养殖成本，因此刺参夏眠研究具有重要的科学意义和产业指导意义。.本项目选取了刺参三个关键夏眠阶段（正常生长期、深度夏眠期和夏眠解除期）组织为材料，筛选了适合于夏眠期间刺参不同组织的最优内参基因组合；建立了刺参夏眠不同阶段肠道和呼吸树组织表达谱，揭示了其基因全局表达模式；克隆分析了刺参甲基化修饰系统关键基因Dnmt1和Mbd2/3的cDNA全长及其在夏眠各阶段的表达水平；检测分析了刺参不同组织在夏眠各阶段的基因组DNA甲基化水平变化。具体研究结果如下：.1.分析了八个常用候选内参基因在刺参夏眠期的表达稳定性并筛选出适合于夏眠期间不同组织的最佳内参基因组合：肠道组织为RPS18、TUBB和NADH；呼吸树组织为ACTB、TUBB和SDHC；肌肉组织为TUBA和NDUFA13。.2.采用RNA-seq技术构建刺参肠道和呼吸树夏眠关键时期的基因表达谱，揭示整个夏眠过程的全局基因表达模式，分析了肠道和呼吸树组织基因表达的共同性和组织特异性。共同差异表达基因主要涉及广泛代谢抑制过程（尤其高耗能生物过程）、能量重调过程以及机体防御与免疫启动过程，而呼吸树组织中细胞周期调控受到明显抑制，表观遗传相关基因转录水平明显变化。.3.克隆获得了刺参DNA甲基化修饰系统中关键基因Dnmt1和Mbd2/3的cDNA全长，且两者均在刺参深度夏眠期肠道组织中表达显著上调，且mbd2/3在深度夏眠期和夏眠解除期的呼吸树组织中持续显著上调表达，其作用位点主要在肠道和呼吸树组织。.4.F-MSAP分析表明刺参四种组织基因组DNA均存在甲基化修饰，不同组织甲基化水平分布在28%-56%范围之间。深度夏眠期，肠道和呼吸树中甲基化水平显著升高，且差异主要表现在全甲基化水平上，而半甲基化水平变化并不显著。肌肉和体壁组织在夏眠各阶段的基因组甲基化水平变化不显著。这一结果直接证实了刺参夏眠期间发生了DNA甲基化调控修饰，且调控位点发生于受夏眠影响最为明显的肠道和呼吸树组织中。.本项目主要探索分析了刺参夏眠期间的DNA甲基化特征，揭示了刺参夏眠的基因表达全局调控模式，为进一步探讨刺参夏眠分子调控机理提供理论参考，并丰富了棘皮动物夏眠理论。