去泛素化酶Otub1调控转录因子c-Maf稳定性的机制及其在多发性骨髓瘤发生中的作用研究

The transcription factor c-Maf is a featured oncogene in multiple myeloma (MM), a hematological malignancy derived from plasma cells. c-Maf is a high risk factor in myelomagenesis and poor prognosis of MM patients. It is well known that c-Maf protein is degraded via the ubiquitin-proteasome pathway and the ubiquitination process is involved in multiple enzymes including ubiquitin activating enzyme, ubiquitin conjugating enzyme, and the ubiquitin ligase. Meanwhile, protein ubiquitination could be reversed and prevented by deubiquitinases or ubiquitin specific proteases. In the analysis of c-Maf interacting proteins by a proteomic strategy, we found that c-Maf interacted with Otub1, one of the key deubiquitinases. Otub1 interacts with c-Maf, preventing its polyubiquitination level and enhances its stability at the protein level, therefore, Otub1 might be a deubiquitinase of c-Maf, but the specific mechanism is yet to know. Therefore, in the present proposal, we will apply various protocols including immunoprecipitation, Western blot, gene truncation, lentiviral infection and xenograft modeling in nude mice, to characterize the interaction between c-Maf and Otub1, to specify deubiquitination of c-Maf, the roles of c-Maf in MM development and proliferation/growth. We will also analyze the association between Otub1 and the therapeutic efficacy and prognosis of MM patients with c-Maf expression. The study will help for the development of targeted therapeutics for MM treatment.

转录因子c-Maf是多发性骨髓瘤（MM）的特征性癌基因，与MM的发生和不良预后密切关联。已知c-Maf可通过泛素-蛋白酶体通路降解，蛋白质的泛素化需要多个酶的参与，包括泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶。同时c-Maf的泛素化水平可以被去泛素化酶所逆转。我们在分析c-Maf相互作用的蛋白质组学研究中发现去泛素化酶Otub1与之相互作用，并抑制c-Maf的多聚泛素化水平，并增加其稳定性，因而推断Otub1为c-Maf可能的去泛素化酶，但机制未明。为此，在本项目中，我们拟在前期研究基础上，进一步利用免疫沉淀、Western blot、基因截短体分析、慢病毒、裸鼠移植模型等试验方法，阐明Otub1与c-Maf相互作用特点，使c-Maf去泛素化的特点、去泛素化的详细机制及其在MM发生和增殖中的作用，并结合临床案例分析Otub1与MM患者治疗和预后的关系，为MM的靶向治疗新药研发提供理论基础。

致癌转录因子 c-Maf 已被提议作为多发性骨髓瘤（MM）的理想治疗靶点，但如何实现它仍然难以捉摸。在本研究中，我们发现了 Otub1/c-Maf 信号轴可能是一个潜在的目标。 Otub1是一种去泛素酶，研究发现与 c-Maf 相互作用，同时Otub1 促进 MM 细胞存活和MM 肿瘤生长。相反，Otub1 的沉默导致 c-Maf 降解和表达 c-Maf 的 MM 细胞的凋亡。因此，Otub1/c-Maf 信号轴可能是 MM 的治疗靶点。为了探索这个概念，我们展开以下研究内容：1、构建Otub1的慢病毒载体侵染 MM 细胞株，研究Otub1对c-Maf泛素化的影响及相关泛素化位点的影响。2、构建Otub1的慢病毒载体及siRNA分别侵染 MM 细胞株，分析Otub1对c-Maf、CCND2、ARK5 和 ITGB7表达的影响。3、通过实验我们筛选出阻止c-Maf泛素化药物，研究其对于MM细胞株生长的影响，探究其对Otub1/c-Maf信号通路的影响。我们发现：1、Otub1通过抑制c-Maf K48位点的泛素化进而抑制c-Maf的降解。2、Otub1促进c-Maf转录活性，通过调控c-Maf泛素化进而影响其下游相关蛋白CCND2、ITGB7 和 ARK5的表达。3、通过研究发现Nanchangmycin可能在 Otub1 存在下抑制 c-Maf 转录活性。通过免疫沉淀、流式细胞等技术我们发现Nam能降低Otub1、c-Maf的表达，同时增加c-Maf的泛素化，降低下游基因信号CCND2、ITGB7 的表达。Nam能引起MM细胞的凋亡。Nam 在 1µM 时显着抑制 MM 患者骨髓干细胞的集落形成，但对健康供体的骨髓没有影响。. 本研究说明Otub1/c-Maf信号通路可能是多发性骨髓瘤治疗的新靶点。Nam能通过Otub1/c-Maf信号通路调节c-Maf泛素化，影响下游基因的表达，诱导MM细胞株凋亡。鉴于Nam的抗癌活性及安全性，为后期Nam可用于多发性骨髓瘤的单药或联合治疗中提供依据。