口蹄疫病毒5'UTR的假结节结构影响宿主嗜性的分子机制

Host tropism variation has been a difficult scientific question and a hot topic in virology. It has been proved that the Cathay isolates of foot-and-mouth disease virus (FMDV) are pig-adapted strains. Besides, the other strains from cattle and sheep have been gradually adapting to pigs in field. Our previous studies have found that the deletion in pseudoknots (PKs) affected the replication and pathogenicity of FMDV. To reveal the role of PKs in host tropism variation of adaption to pigs of FMDV, we will determine the role of PKs in viral replication and pathogenicity, and identify the potential host proteins that interact with PKs using reverse genetics, RNA-protein pull-down, CRISPR-Cas9 and other methods. Furthermore, the interaction domain or regions between PKs and host proteins will be identified. The roles of the identified host proteins in the replication and pathogenicity of FMDV and the involved molecular mechanisms will be further determined. The transcripts, protein expression, phosphorylation and ubiquitination levles of the adaptor proteins in the signaling pathway and it’s downstream effective molecules that induced by PK and host protein will be analyzed. This study will provide a theoretical basis to understand the host tropism variation of adaption to pigs of FMDV as well as exploit a strategy for swine FMD control.

宿主嗜性变异一直是病毒学研究的一个热点和难点问题，口蹄疫病毒除了已被证明O型Cathay谱系毒株是适应猪毒株外，还出现了其它毒株从牛羊感染逐步适应到猪的临床现象。我们的前期研究证明，除了3A缺失导致对猪适应变异外，假结节（PK）结构的缺失是口蹄疫病毒适应猪新的决定因素。为了阐明口蹄疫病毒适应猪背后新的分子机制，本项目通过反向遗传操作、RNA与蛋白互作、基因编辑等技术，在细胞和宿主水平，鉴定不同PK结构对病毒复制、致病性和宿主嗜性的作用及其功能域。筛选与PK结构互作的宿主蛋白，并确定其对病毒复制和致病性的影响；据筛选的宿主蛋白功能及其信号转导路径，开展PK结构对靶标蛋白的调控及信号转导机制研究，检测PK与宿主蛋白互作对信号通路节点蛋白转录、表达、磷酸化和泛素化的影响，检测被影响的节点蛋白下游效应分子的变化，为阐明口蹄疫病毒适应猪的宿主嗜性变异的新机制奠定基础。

口蹄疫病毒除了已被证明的O型Cathay谱系毒株是嗜猪毒株外，近年来还出现了其它谱系毒株从牛羊感染逐步适应到猪的临床现象。本项目分离鉴定了我国流行毒株中PKs区缺失86个核苷酸的O型PanAsia毒株O/GD/CHA/2015，证实了的O/GD/CHA/2015只感染猪而对牛无致病性。为了阐明病毒适应猪背后新的分子机制，本项目通过反向遗传操作、RNA与蛋白互作等技术，在细胞和宿主水平，开展了不同PK结构缺失对病毒复制、致病性和宿主嗜性的影响研究。结果证实PK区86个核苷酸的缺失是口蹄疫病毒PanAsia毒株从牛适应猪的决定因素，而Cathay毒株中除已经报道的3A基因的缺失外，其PK区均存在的43个核苷酸的缺失也是病毒适应猪的决定因素。相关PK区域的缺失能够引起PanAsia毒株宿主嗜性的变化。进一步开展了PK去4个结节PKsI区、PKsII区、PKsIII区和PKsIV区的功能研究，发现了PKsI区对稳定PK区的稳定具有重要作用，PKsII区和PKsIII区缺失能够降低病毒对牛的致病性，而PKsIV区的缺失与病毒宿主嗜性的变异具有最重要的关联，能够导致病毒对牛致病能力的完全丧失。通过RNA pull down结合蛋白质谱鉴定了与PK区发生互作的宿主蛋白。证实了能够特异性结合RNA片段的宿主蛋白PCBP2能够与口蹄疫病毒的PK区结合，并且发现PCBP2也可以促进口蹄疫病毒的复制，PCBP2能够与口蹄疫病毒RNA复制聚合酶3D蛋白发生相互作用，PCBP2在病毒复制过程中可能通过3D协同促进病毒复制。同时，本项目开展了病毒RNA结合蛋白NOD2及DDX56调控口蹄疫病毒复制的分子机制研究，证实NOD2可以抑制口蹄疫病毒复制，而DDX56则能够促进病毒复制。本研究鉴定了PK区缺失是口蹄疫病毒从牛适应猪的决定因素，为牛弱毒疫苗为什么不能用于猪口蹄疫防控的历史科学问题给出答案。鉴定了能够与口蹄疫病毒RNA互作调控病毒复制的宿主蛋白与机制，为系统阐明口蹄疫病毒适应猪的宿主嗜性变异机制奠定基础，也为猪口蹄疫的防控提供了科学理论依据。